Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Visualisierung von GFP-markierten IELs mit intravitaler Bildgebung des murinen Dünndarms durch invertierte Konfokalmikroskopie der Spinnscheibe. Diese Technik ermöglicht die Verfolgung von lebenden Zellen innerhalb der Schleimhaut für bis zu 4 h und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von darmen immun-epitheliale Wechselwirkungen zu untersuchen.
Abstract
Intraepitheliale Lymphozyten, die den T-Zellrezeptor exzessikuliert, spielen eine Schlüsselrolle bei der Immunüberwachung des Darmepithels. Aufgrund des Fehlens eines endgültigen Liganden für den T-Zellrezeptor bleibt unser Verständnis der Regulation der IEL-Aktivierung und ihrer Funktion in vivo begrenzt. Dies erfordert die Entwicklung alternativer Strategien zur Abhörung von Signalwegen, die an der Regulierung der IEL-Funktion und der Reaktionsfähigkeit dieser Zellen auf die lokale Mikroumgebung beteiligt sind. Obwohl IELs weithin verstanden werden, um die Pathogentranslokation zu begrenzen, war die Verwendung von intravitaler Bildgebung entscheidend für das Verständnis der räumlich-zeitlichen Dynamik von IEL/epithelialen Wechselwirkungen im stationären Zustand und als Reaktion auf invasive Krankheitserreger. Hierin stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung des IEL-Migrationsverhaltens in der kleinen Darmschleimhaut einer GFP-T-Zellreportermaus mit invertierter Konokallasermikroskopie der Spinnscheibe vor. Obwohl die maximale Bildtiefe dieses Ansatzes im Vergleich zur Verwendung der Zwei-Photonen-Laserscanmikroskopie begrenzt ist, bietet die konfokale Lasermikroskopie der Spinnscheibe den Vorteil der Hochgeschwindigkeits-Bildaufnahme mit reduzierter Photobleichung und Photodamage. Mit Hilfe der 4D-Bildanalyse-Software können das T-Zell-Überwachungsverhalten und ihre Wechselwirkungen mit benachbarten Zellen nach experimenteller Manipulation analysiert werden, um zusätzliche Einblicke in die IEL-Aktivierung und -Funktion innerhalb der Darmschleimhaut zu geben.
Introduction
Intraepitheliale Lymphozyten (IEL) befinden sich im Darmepithel und finden sich sowohl entlang der Kellermembran als auch zwischen benachbarten Epithelzellen im lateralen interzellulären Raum1. Es gibt etwa einen IEL für jede 5-10 Epithelzellen; Diese IELs dienen als Wächter, um die große Weite der Darmepithelbarriere immun zu überwachen2. IELs, die den T-Zell-Rezeptor (TCR) exemiten, machen bis zu 60 % der gesamten IEL-Population im murinen Dünndarm aus. Studien an T-Zell-Mäusen zeigen eine weitgehend schützende Rolle dieser Zellen als Reaktion auf Darmverletzungen, Entzündungen und Infektionen3,4,5. Trotz der Erzeugung der Tcrd-Knockout-Maus6ist unser Verständnis der IEL-Biologie zum Teil darauf beschränkt, dass Liganden, die von der TCR erkannt werden, noch nicht identifiziert werden müssen7. Infolgedessen hat der Mangel an Werkzeugen zur Untersuchung dieser Zellpopulation es schwierig gemacht, die Rolle der TCR-Aktivierung und -Funktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Um diese Lücke zu schließen, haben wir Live-Bildgebungstechniken entwickelt, um das IEL-Migrationsverhalten und die Interaktionen mit benachbarten Enterozyten zu visualisieren, um zusätzliche Einblicke in die IEL-Funktion und die Reaktionsfähigkeit auf externe Reize in vivo zu geben.
In den letzten zehn Jahren hat die intravitale Bildgebung unser Verständnis der molekularen Ereignisse, die an mehreren Facetten der Darmbiologie beteiligt sind, einschließlich epithelialen Zellabwurfs8, Regulierung der epithelialen Barrierefunktion 9 erheblich erweitert. ,10, myeloische Zellentnahme von Luminalinhalten11,12und Wirtsmikroben-Wechselwirkungen11,13,14,15,16 . Im Kontext der IEL-Biologie hat der Einsatz der intravitalen Mikroskopie die raumzeitliche Dynamik der IEL-Motilität und die Faktoren, die ihr Überwachungsverhalten vermitteln,beleuchtet 13,14,15, 16. Die Entwicklung von TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) Reportermäusen, die DIE IELs nach dem kernadischen GFP-Ausdruck17kennzeichnen, zeigte, dass IELs innerhalb des Epithels hochmotil sind und ein einzigartiges Überwachungsverhalten aufweisen, das auf mikrobielle Infektion17,13,14. Kürzlich wurde eine weitere “T-Zellreporter-Maus”(Tcrd-GDL) entwickelt, die GFP im Zytoplasma ausdrückt, um die Visualisierung der gesamten Zelle18zu ermöglichen. Ähnliche Methoden wurden verwendet, um die Anforderung von spezifischen Chemokin-Rezeptoren, wie G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-18 und -55, auf die Dynamik der IEL-Motilität19,20zu untersuchen. In Ermangelung eines zellspezifischen Reporters wurden fluoreszierende konjugierte Antikörper gegen CD8 verwendet, um Die IEL-Motilität in vivo19,20zu visualisieren und zu verfolgen. Obwohl die Zwei-Photonen-Laserscanmikroskopie häufig für die intravitale Bildgebung verwendet wird, bietet die Verwendung der konfokalen Lasermikroskopie einzigartige Vorteile, um hochauflösende und hochauflösende Mehrkanalbilder mit minimalem Hintergrundrauschen zu erfassen. Diese Technologie ist ideal, um die raumzeitliche Dynamik von immun-epitheliaalen Wechselwirkungen innerhalb der komplexen Mikroumgebung der Darmschleimhaut aufzuklären. Darüber hinaus können diese Studien durch den Einsatz verschiedener transgener und/oder Knockout-Mausmodelle Einblicke in die molekulare Regulation der Darmimmun- und/oder Epithelzellfunktion geben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entwicklung von intravitalen Mikroskopie-Techniken hat eine beispiellose Gelegenheit geboten, die Reorganisation subzellulärer Strukturen zu beobachten8,9,22, Zell-Zell-Wechselwirkungen12, 25 und Zellmigrationsverhalten13,14,15,16,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird unterstützt von NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Wir danken Madeleine Hu für ihre Unterstützung bei der Bearbeitung des Manuskripts und der Bereitstellung der in den repräsentativen Ergebnissen dargestellten Daten.
Materials
| 35mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
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