التصوير داخل الظهارة من الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة في الميورين الأمعاء الدقيقة
Summary
نحن نوصف طريقة لتصور GFP المسمى + IELs باستخدام التصوير داخل vital من الأمعاء الدقيقة مورين عن طريق عكس الغزل القرص المجهر confocal. هذه التقنية تمكن من تتبع الخلايا الحية داخل الغشاء المخاطي لمدة تصل إلى 4 ح ويمكن استخدامها للتحقيق في مجموعة متنوعة من التفاعلات المعوية المناعية الظهارية.
Abstract
الخلايا الليمفاوية داخل الظهارية التي تعبر عن مستقبلات الخلايا التّية (γ δ IEL) تلعب دوراً رئيسياً في المراقبة المناعية للظهارة المعوية. ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود ليجاننهائي لمستقبلات الخلية T γδ, فهمنا لتنظيم التنشيط iEL γδ ووظيفتها في الجسم الحي لا يزال محدودا. وهذا يتطلب وضع استراتيجيات بديلة لاستجواب مسارات الإشارة التي تنطوي على تنظيم وظيفة IEL δ ومدى استجابة هذه الخلايا للبيئة الدقيقة المحلية. على الرغم من أن الـ IELs من المفهوم على نطاق واسع للحد من نقل الممرض، فإن استخدام التصوير داخل الفيتال كان حاسماً لفهم الديناميات المكانية المكانية للتفاعلات الظهارية IEL/في حالة ثابتة واستجابة لمسببات الأمراض الغازية. هنا، نقدم بروتوكولا لتصور سلوك الهجرة IEL في الغشاء المخاطي المعوي ة من الماوس مراسل الخلية ت gfp باستخدام مقلوب الغزل القرص cofocal الليزر المجهري. على الرغم من أن عمق التصوير الأقصى لهذا النهج محدود بالنسبة لاستخدام المجهر المسح الضوئي بالليزر اثنين من الفوتونات، والغزل القرص مجهر الليزر البؤري يوفر ميزة الحصول على صورة عالية السرعة مع انخفاض photobleaching و الصورة الضرر. باستخدام برنامج تحليل الصور 4D، يمكن تحليل سلوك مراقبة الخلايا T وتفاعلاتها مع الخلايا المجاورة بعد التلاعب التجريبي لتوفير نظرة ثاقبة إضافية في تفعيل IEL ووظيفة داخل الغشاء المخاطي المعوي.
Introduction
توجد الخلايا اللمفاوية داخل الظهارة داخل الظهارة المعوية، وتوجد على طول غشاء الطابق السفلي وبين الخلايا الظهارية المجاورة في الفضاء الجانبي بين الخلايا1. هناك تقريبا واحد IEL لكل 5-10 خلايا الظهارية; هذه العبوات اللي ة كحراس لتوفير المراقبة المناعية للامتداد الكبير للحاجز الظهاري المعوي2. تشكل الـ IELs التي تعبر عن مستقبلات الخلايا t (TCR) ما يصل إلى 60% من إجمالي عدد السكان في الأمعاء الدقيقة في المورين. الدراسات في الفئران التي تعاني من نقص الخلايا التائية تتثبت من دور وقائي لهذه الخلايا استجابة لإصابة الأمعاء والتهاب والعدوى3,4,5. على الرغم من جيل من Tcrd خروج المغلوب الماوس6, فهمنا لالبيولوجيا IEL γδ لا يزال محدودا ويرجع ذلك جزئيا إلى حقيقة أن الليجانس المعترف بها من قبل tcr γδ لم يتم تحديدها بعد7. ونتيجة لذلك، فإن عدم وجود أدوات لدراسة هذه الخلايا السكان جعلت من الصعب التحقيق في دور تنشيط ووظيفة tCR γδ في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. لسد هذه الفجوة، قمنا بتطوير تقنيات التصوير الحي لتصور سلوك الهجرة IEL δ δ والتفاعلات مع الخلايا المعوية المجاورة كوسيلة لتوفير نظرة إضافية على وظيفة IEL والقدرة على الاستجابة للمحفزات الخارجية في الجسم الحي.
على مدى العقد الماضي، وسعت التصوير داخل الحيوية بشكل كبير فهمنا للأحداث الجزيئية التي تنطوي على جوانب متعددةمن البيولوجيا المعوية، بما في ذلك الخلايا الظهارية سفك 8، وتنظيم وظيفة الحاجز الظهاري9 ،10،عينة الخلية النقوي من المحتويات المضيئة11،12، وتفاعلات المضيف ميكروب11،13،14،15،16 . في سياق علم الأحياء IEL، وقد ألقى استخدام المجهر داخل الفيتال الضوء على ديناميات المكانية الصدغية من الحركة IEL والعوامل التي تتوسط سلوك المراقبة13،14،15، 16. تطور TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) مراسل الفئران, الذي تسميات + IELs من قبل التعبير النووي GFP17, كشفت أن المحطات المثيلة هي motile عالية داخل ظهارة ومعرض سلوك مراقبة فريدة من نوعها التي تستجيب للميكروبات العدوى17,13,14. في الآونة الأخيرة، تم تطوير آخر ماوس مراسل الخلية t γδ (Tcrd-GDL) الذي يعبر عن GFP في السيتوبلازم للسماح تصور الخلية بأكملها18. وقد استخدمت منهجية مماثلة للتحقيق في متطلبات مستقبلات كيميائية محددة، مثل مستقبلات G البروتين مقرونة (GPCR)-18 و -55، على ديناميات الحركة IEL19،20. في غياب مراسل خلية محددة، استخدمت الأجسام المضادة المترافقة الفلورسنت ضد CD8α لتصور وتتبع حركة IEL في الجسم الحي19،20. على الرغم من أن المجهر المسح الضوئي بالليزر باثنين من الفوتونات يستخدم عادة في التصوير داخل الفيتال، فإن استخدام المجهر الليزري البؤري للقرص الدوار يوفر مزايا فريدة لالتقاط صور عالية السرعة وعالية الدقة متعددة القنوات مع الحد الأدنى من الضوضاء الخلفية. هذه التكنولوجيا مثالية لتوضيح الديناميات المكانية المكانية المكانية للتفاعلات المناعية/الظهارية داخل البيئة الدقيقة المعقدة للغشاء المخاطي المعوي. وعلاوة على ذلك، من خلال استخدام مختلف نماذج الماوس المعدلة وراثيا و / أو خروج المغلوب، وهذه الدراسات يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في التنظيم الجزيئي للمناعة المعوية و / أو وظيفة الخلية الظهارية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أتاح تطوير تقنيات الفحص المجهري داخل الفيتال فرصة غير مسبوقة لمراقبة إعادة تنظيم الهياكل الفرعية8و9و22و تفاعلات الخلية12، 25 وسلوك هجرة الخلية13،14،15…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R21 AI143892، نيو جيرسي منحة مؤسسة الصحة، بوش الطبية الحيوية غرانت (KLE). نشكر مادلين هو على مساعدتها في تحرير المخطوطة وتقديم البيانات الواردة في النتائج التمثيلية.
Materials
| 35mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
References
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
- Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
- Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
- Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
- Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
- Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
- Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
- Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
- Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
- Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
- Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
- Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
- Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
- Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
- Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
