Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon
Summary
Bu protokolün amacı kollajenaz kullanarak dokunun enzimatik sindirimi ile kolon lamina propria bulunan mononükleer hücreleri izole etmektir. Bu protokol, mononükleer hücrelerin verimli bir şekilde izolasyonuna olanak sağlar ve bu da sağlam immünhenototipleme için kullanılabilir tek bir hücre süspansiyonu ile sonuçlanır.
Abstract
Bağırsak vücutta bağışıklık hücrelerinin en çok sayıda ev sahipliği yapmaktadır. Küçük ve kalın bağırsak bağışıklık sistemleri polis eksojen antijenlere maruz kalma ve güçlü mikrobiyal türetilmiş bağışıklık uyaranları yanıtları modüle. Bu nedenle bağırsak, crohn hastalığı ve ülseratif kolit, kemik sonrası greft-versus-host hastalığı (GVHD) gibi inflamatuar barsak hastalıkları ile sınırlı olmamak üzere birçok hastalıkta immün disregülasyon ve iltihabın önemli bir hedef alanıdır. ilik nakli (BmT) ve birçok alerjik ve enfeksiyöz durum. Gastrointestinal inflamasyon ve kolit Murine modelleri yoğun GI komplikasyonları çalışma ve ön klinik önleme ve tedavi için stratejiler optimize etmek için kullanılır. Bağırsaktan bağışıklık hücrelerinin izolasyon ve henotipik analizi ile bu modellerden toplanan veriler, gastrointestinal ve sistemik inflamatuar hastalıkların iyileştirilmesiiçin uygulanabilecek daha fazla bağışıklık anlayışı için önemlidir. Bu rapor, karışık silika bazlı yoğunluk gradyan arabirimi kullanarak kolondan mononükleer hücrelerin (MNC) izolasyonu için son derece etkili bir protokol açıklanmaktadır. Bu yöntem, önemli sayıda canlı lökositi izole ederken, enkazı kirleten enkazı en aza indirir, akış sitometrisi veya diğer yöntemlerle sonraki immün fenotitiplemesağlar.
Introduction
Gastrointestinal (GI) yolu öncelikle gıda besin işleme ve reabsorbsiyon adanmış olmasına rağmen, GI sistemi de vasküler bütünlüğü merkezi rolleri korur, lenfatik, ve sinir sistemleri ve çok sayıda diğer organların aracılığıyla mukozal ve submukozal bağışıklık sistemi1. GI bağışıklık sistemi gıda yabancı antijenlere sürekli maruz kalma nedeniyle hem gastrointestinal ve sistemik sağlık etkili bir role sahiptir, kommensal bakteriler, ya da işgal patojenler1,2. Böylece, GI bağışıklık sistemi patojenik antijenler uygun yanıt verirken patojenik olmayan antijenler tolere hangi hassas bir denge korumak gerekir1,2. Tolerans ve savunma dengesi bozulduğunda, lokalize veya sistemik immün disregülasyon ve inflamasyon hastalıkların sayısız neden oluşabilir1,2,3.
Bağırsak, vücuttaki tüm lenfoid hücrelerin en az %70’ini barındırır4. En primer immünolojik etkileşimler bağırsakta üç bağışıklık istasyonlarıen en az birini içerir: 1) Peyer’s Patches, 2) İntraepitelyal lenfositler (IEL) ve 3) lamina propria lenfositler (LPL). Bunların her biri hızlabağırsak5 normal bağışıklık sorunlarına yanıt bağışıklık hücrelerinin karmaşık bir birbirine bağlı ağ oluşur . Muscularis mukoza üzerinde stroma sınırlı, gevşek yapılandırılmış lamina propria bağırsak mukozasının bağ dokusu ve villus için iskele içerir, vaskülatür, lenfatik drenaj, ve mukozal sinir sistemi, yanı sıra birçok doğuştan ve adaptif bağışıklık alt kümeleri6,7,8,9. LPL 2:1 yaklaşık oranda CD4+ ve CD8+ T hücrelerinden, plazma hücreleri ve miyeloid soy hücreleri, dendritik hücreler, mast hücreleri, eozinofiller ve makrofajlar6dahil olmak üzere oluşur.
Çeşitli hastalık durumları ile ilgili olarak bağışıklık disregülasyonu ve bağırsak iltihabı anlamada artan bir ilgi vardır. Crohn hastalığı ve ülseratif kolit gibi koşullar tüm kolonik inflamasyon10,11,12değişen düzeylerde tezahür . Ayrıca, allojenik kemik iliği nakli (allo-BMT) geçiren ilik veya bağışıklık sisteminin malign veya malign olmayan bozuklukları olan hastalar, klima rejimlerinden doğrudan toksisite dahil olmak üzere çeşitli kolit formları gelişebilir. BMT önce, 2) BMT ve 3 sonra immünsupresyon neden enfeksiyonları) greft-versus-host hastalığı (GVHD) BMT sonra dokularda donör allo-antijenlere tepki donör tipi T hücreleri tarafından tahrik13,14,15. Tüm bu post-BmT komplikasyonları bağırsakların bağışıklık ortamında önemli değişikliklere neden16,17,18. Önerilen yöntem fare kolon bağışıklık hücre birikiminin güvenilir bir değerlendirme sağlar ve, BMT sonra murin alıcılara uygulandığında, organ toleransı dahil hem donör ve alıcı bağışıklık hücreleri etkili bir tahsin kolaylaştırır19 ,20. Bağırsak iltihabı ek nedenleri maligniteler dahil, gıda alerjileri, ya da bağırsak mikrobiyom bozulması. Bu protokol kolon dan bağırsak mononükleer hücrelerin inerişimini sağlar ve değişiklikler ile, bu preklinik murine modellerinin herhangi bir ince bağırsak lökositler için.
“Bağırsak ve bağışıklık hücresi VE izolasyon” arama terimlerini kullanarak bir PubMed arama bağışıklık hücreleri ayıklamak için ince bağırsak sindirim yöntemleri açıklayan 200’den fazla yayınlar ortaya koymaktadır. Ancak, kolon için benzer bir literatür arama kolon bağışıklık hücrelerinin izolasyon belirten iyi kalibre protokolleri verir. Kolon daha kas ve interstisyel tabakaları vardır, çünkü bu daha zor tamamen ince bağırsak daha sindirimi için render olabilir. Mevcut protokollerin aksine, bu protokol özellikle diğer bakteriyel kollajenazlar olmadan Clostridium histolyticum kollajenaz E kullanır (Kollajenaz D / Kollajenaz I). Bu protokol kullanılarak, izole bağırsak mononükleer bağışıklık hücrelerinin (MNC) kalitesini koruyarak, sodyum versenaton (EDTA), Dispase II ve deoksiribonuklease I (DNAse I)21,22,23. Bu protokol daha fazla yönlendirilmiş çalışmalar için murine kolon canlı MNC tekrarlanabilir sağlam çıkarma sağlamak için optimize edilmiş ve kolon immünoloji sinması çalışmasına kendini ödünç vermelidir veya (modifikasyonlar ile) ince bağırsak24, 25. yıl.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu görsel protokol lamina propria lenfositler de dahil olmak üzere kolon mononükleer hücrelerin izolasyon için iyi tolere yöntemleri açıklar (LPL). Bu protokol, inflamatuar sitokinlerin ve doku yaralanmalarının kurtarılan MNC’nin yetersiz canlılığına katkıda bulunduğu ciddi nakil sonrası fare kolit modellerinin değerlendirilmesinde optimize edildiği göz önüne alındığında, bu yöntemlerin diğer kolon MNC’nin henotik analizini gerektiren uygulamalar. Bunlar arasında inflamatuar barsak hastalı?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma #1K08HL088260 ve #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) ve Batchelor Pediatrik Araştırmalar Vakfı (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan C57BL/6 ve BALB/c fareleri ya tesisimizde yetiştirildi ya da Jackson Labs veya Taconic tarafından sağlandı.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
References
- Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
- Harb, W. J. Crohn’s Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases – A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j., Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
