Aislamiento de células mononucleares lamina Propria de Colon Murino usando colagenasa E
Summary
El objetivo de este protocolo es aislar las células mononucleares que residen en la lámina propria del colon mediante la digestión enzimática del tejido utilizando la colagenasa. Este protocolo permite el aislamiento eficiente de las células mononucleares, lo que resulta en una suspensión de una sola célula que, a su vez, se puede utilizar para un inmunofenotipado robusto.
Abstract
El intestino es el hogar del mayor número de células inmunitarias en el cuerpo. Los sistemas inmunitarios intestinales pequeños y grandes controlan la exposición a antígenos exógenos y modulan las respuestas a potentes estímulos inmunes derivados microbianamente. Por esta razón, el intestino es un sitio objetivo importante de la desregulación inmune y la inflamación en muchas enfermedades, incluyendo pero, no limitado a enfermedades inflamatorias intestinales como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, enfermedad injerto-versus-huésped (GVHD) después de hueso hueso trasplante de médula (BMT), y muchas afecciones alérgicas e infecciosas. Los modelos murinos de inflamación gastrointestinal y colitis se utilizan en gran medida para estudiar las complicaciones gastrointestinales y para optimizar previamente las estrategias para la prevención y el tratamiento. Los datos obtenidos de estos modelos a través del aislamiento y el análisis fenotípico de las células inmunitarias del intestino son fundamentales para una mayor comprensión inmune que se puede aplicar para mejorar los trastornos inflamatorios gastrointestinales y sistémicos. Este informe describe un protocolo altamente eficaz para el aislamiento de células mononucleares (MNC) del colon utilizando una interfaz de gradiente de densidad basada en sílice mixta. Este método aísla reproduciblemente a un número significativo de leucocitos viables al tiempo que minimiza los desechos contaminantes, permitiendo el fenotipado inmune posterior por citometría de flujo u otros métodos.
Introduction
Aunque el tracto gastrointestinal (GI) se dedica principalmente al procesamiento y reabsorción de nutrientes de los alimentos, el tracto gastrointestinal también mantiene roles centrales en la integridad de los sistemas vascular, linfático y nervioso y de numerosos otros órganos a través de su sistema inmunológico mucoso y submucoso1. El sistema inmunitario GASTROINTESTINAL tiene un papel influyente en la salud gastrointestinal y sistémica debido a su exposición constante a antígenos extraños de alimentos, bacterias comensales o patógenos invasores1,2. Por lo tanto, el sistema inmunitario GI debe mantener un delicado equilibrio en el que tolera antígenos no patógenos, respondiendo adecuadamente a los antígenos patógenos1,2. Cuando se interrumpe el equilibrio de tolerancia y defensa, se puede localizar o sistémicamente la desregulación inmune y la inflamación, lo que resulta en una miríada de enfermedades1,2,3.
El intestino alberga al menos el 70% de todas las células linfoides del cuerpo4. La mayoría de las interacciones inmunológicas primarias involucran al menos una de las tres estaciones inmunitarias en el intestino: 1) Parches de Peyer, 2) linfocitos intraepiteliales (IEL) y 3) linfocitos de lamina propria (LPL). Cada uno de ellos se compone de una compleja red interconectada de células inmunitarias que responden rápidamente a los desafíos inmunes normales en el intestino5. Restringida al estroma por encima de las mucosas musculares, la lámina propria de estructura suelta es el tejido conectivo de la mucosa intestinal e incluye andamios para la vellosidad, la vasculatura, el drenaje linfático y el sistema nervioso de la mucosa, así como muchos innatos y subconjuntos inmunes adaptativos6,7,8,9. LPL se componen de células CD4+ y CD8+ T en una proporción aproximada de 2:1, células plasmáticas y células de linaje mieloides incluyendo, células dendríticas, células de mástil, eosinófilos y macrófagos6.
Hay un creciente interés en entender la desregulación inmune y la inflamación del intestino, ya que se refiere a varios estados de la enfermedad. Tales condiciones como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa todos manifiestan diferentes niveles de inflamación del colon10,11,12. Además, los pacientes con trastornos malignos o no malignos de la médula o del sistema inmunitario que se someten a un trasplante alogénico de médula ósea (alo-BMT) pueden desarrollar diversas formas de colitis, incluyendo 1) toxicidad directa por regímenes de acondicionamiento antes de BMT, 2) infecciones causadas por inmunosupresión después de la Enfermedad contra huésped de injerto contra huésped (EICH) impulsadapor por células T de tipo donante reaccionando a los antígenos alógenos de donantes en los tejidos después de BMT13,14,15. Todas estas complicaciones post-BMT resultan en alteraciones significativas en el ambiente inmune de los intestinos16,17,18. El método propuesto permite una evaluación fiable de la acumulación de células inmunitarias en el colon del ratón y, cuando se aplica a los receptores murinos después de la BMT, facilita un ensayo eficiente de las células inmunitarias de los donantes y receptores implicadas en la tolerancia al trasplante19 ,20. Otras causas de inflamación intestinal incluyen neoplasias malignas, alergias alimentarias o alteración del microbioma intestinal. Este protocolo permite el acceso de células mononucleares intestinales desde el colon y, con modificaciones, a leucocitos del intestino delgado en cualquiera de estos modelos murinos preclínicos.
Una búsqueda de PubMed utilizando los términos de búsqueda “intestino y aislamiento de células inmunitarias Y” revela más de 200 publicaciones que describen métodos para la digestión del intestino delgado para extraer células inmunitarias. Sin embargo, una búsqueda de literatura similar para el colon no produce protocolos bien delineados que especifican el aislamiento de las células inmunitarias del colon. Esto puede deberse a que el colon tiene más capas musculares e intersticiales, lo que hace más difícil digerir completamente que el intestino delgado. A diferencia de los protocolos existentes, este protocolo utiliza específicamente la colagenasa E de Clostridium histolyticum sin otras colagenasas bacterianas (Collagenasa D/Collagenasa I). Demostramos que, utilizando este protocolo, se puede lograr la digestión del tejido colonico preservando la calidad de las células inmunitarias mononucleares intestinales aisladas (MNC) sin la adición de reactivos anti-aglutinantes como el alfrente de sodio (EDTA), Dispase II, y desoxirribonuclea I (DNAse I)21,22,23. Este protocolo está optimizado para permitir la extracción robusta reproducible de MNC viable del colon murino para estudios más dirigidos y debe prestarse al estudio de la inmunología del colon o (con modificaciones) del intestino delgado24, 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo visual describe métodos bien tolerados para el aislamiento de células mononucleares colónicas, incluidos linfocitos de lamina propria (LPL). Dado que este protocolo se optimizó en la evaluación de modelos graves de colitis de ratón post-trasplante donde las citoquinas inflamatorias y las lesiones tisulares se prestan a la mala viabilidad de la MNC recuperada, anticipamos que estos métodos pueden traducirse a otros aplicaciones que requieren análisis fenotípicos del MNC colonico. Estos incluyen per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones #1K08HL088260 y #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), y la Fundación Batchelor para la Investigación Pediátrica (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Los ratones C57BL/6 y BALB/c utilizados en este estudio fueron criados en nuestras instalaciones o proporcionados por Jackson Labs o Taconic.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
References
- Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
- Harb, W. J. Crohn’s Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases – A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j., Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
