Isolamento delle cellule mononucleari Di Lamina propria dal colon Murine utilizzando Collagenase E

Sebbene il tratto gastrointestinale (GI) sia principalmente dedicato alla lavorazione e al riassorbimento dei nutrienti dagli alimenti, il tratto GI mantiene anche un ruolo centrale nell’integrità del sistema vascolare, linfatico e nervoso e di numerosi altri organi attraverso il suo sistema immunitario mucosale e submucosale¹. Il sistema immunitario GI ha un ruolo influente nella salute gastrointestinale e sistemica a causa della sua costante esposizione a antigeni estranei da alimenti, batteri commensici o agenti patogeni invasori^1,2. Pertanto, il sistema immunitario GI deve mantenere un delicato equilibrio in cui tollera gli antigeni non patogeni rispondendo in modo appropriato agli antigeni patogeni^1,2. Quando l’equilibrio di tolleranza e difesa viene interrotto, localizzato o sistemico immune diregolazione e infiammazione può verificarsi con conseguente una miriade di malattie^1,2,3.

L’intestino ospita almeno il 70% di tutte le cellule linfoidi nel corpo⁴. La maggior parte delle interazioni immunologiche primarie coinvolgono almeno una delle tre stazioni immunitarie dell’intestino: 1) Peyer’s Patches, 2) Linfociti intraeliali (IEL) e 3) linfociti di lamina (LPL). Ognuna di queste è costituita da una complessa rete interconnessa di cellule immunitarie che rispondono rapidamente alle normali sfide immunitarie nell’intestino⁵. Limitata allo stroma sopra la mucosae muscolosa, la lamina vagamente strutturata propria è il tessuto connettivo della mucosa intestinale e comprende impalcature per il villus, la vascolatura, il drenaggio linfatico e il sistema nervoso mucosale, così come molti e sottoinsiemi immunitari adattivi^6,7,8,9. LPL è composto da cellule^{T CD4} e CD8 in un rapporto approssimativo di 2:1, cellule plasmatiche e cellule di lignaggio mieloidi tra cui, cellule dendritiche, mastociti, eosinofili e macrofagi⁶.

C’è un crescente interesse nella comprensione della disregolazione immunitaria e dell’infiammazione dell’intestino in quanto si prova per vari stati di malattia. Tali condizioni come la malattia di Crohn e la colite ulcerosa manifestano tutti diversi livelli di infiammazione colonica^10,11,12. Inoltre, i pazienti con disturbi maligni o non maligni del midollo o del sistema immunitario sottoposti a trapianto di midollo osseo allogenico (allo-BMT) possono sviluppare varie forme di colite, tra cui 1) tossicità diretta da regimi condizionanti prima del BMT, 2) infezioni causate dall’immunosoppressione dopo BMT e 3) malattia di innesto-contro-ospite (GVHD) causata da cellule T di tipo donatore che reagiscono agli allogenesti donatori nei tessuti dopo BMT^13,14,15. Tutte queste complicazioni post-BMT provocano alterazioni significative nell’ambiente immunitario dell’intestino^16,17,18. Il metodo proposto consente una valutazione affidabile dell’accumulo di cellule immunitarie nel colon del topo e, quando applicato ai destinatari murini dopo BMT, facilita un saggio efficiente delle cellule donatrici e immunitarie riceventi coinvolte nella tolleranza dei^{trapianti 19 ,20}. Ulteriori cause di infiammazione intestinale includono malignità, allergie alimentari, o interruzione del microbioma intestinale. Questo protocollo consente l’accesso alle cellule mononucleari intestinali dal colon e, con modifiche, ai leucociti dell’intestino tenue in uno di questi modelli murini preclinici.

Una ricerca PubMed usando i termini di ricerca “intestine e cellule immunitarie e isolamento” rivela oltre 200 pubblicazioni che descrivono i metodi per la digestione dell’intestino tenue per estrarre le cellule immunitarie. Tuttavia, una ricerca simile alla letteratura per il colon non produce protocolli ben delineati che specificano l’isolamento delle cellule immunitarie dal colon. Questo può essere perché il colon ha strati più muscolari e interstiziali, rendendo più difficile da digerire completamente rispetto all’intestino tenue. A differenza dei protocolli esistenti, questo protocollo utilizza specificamente Collagenase E di Clostridium histolyticum senza altre collagene batteriche (Collagenase D/ Collagenase I). Dimostriamo che, utilizzando questo protocollo, la digestione del tessuto colonico può essere raggiunta preservando la qualità delle cellule immunitarie mononucleari dell’intestino isolate (MNC) senza l’aggiunta di reagenti anti-agglomeranti come il versinato di sodio (EDTA), diSpase II e deoxyribonuclease I (DNasie I)^21,22,23. Questo protocollo è ottimizzato per consentire l’estrazione robusta riproducibile di MNC vitale dal colon murino per ulteriori studi diretti e dovrebbe prestarsi allo studio dell’immunologia del colon o (con modifiche) dell’intestino tenue^{24, 25}.