Isolierung von Lamina Propria Mononukleären Zellen aus murine Colon mit Kollagenase E

Obwohl der Magen-Darm-Trakt (GI) in erster Linie der Verarbeitung und Resorption von Nährstoffen aus Der Nahrung gewidmet ist, behält der GI-Trakt auch zentrale Rollen in der Integrität des Gefäß-, Lymph- und Nervensystems und zahlreicher anderer Organe durch schleimhaut- und submukosalen^{Immunsystems 1}. Das GI-Immunsystem hat eine einflussreiche Rolle sowohl in der gastrointestinalen als auch in der systemischen Gesundheit aufgrund seiner konstanten Exposition gegenüber fremden Antigenen aus Lebensmitteln, kommensalen Bakterien oder eindringenden Krankheitserregern^1,2. So muss das GI-Immunsystem ein empfindliches Gleichgewicht aufrechterhalten, in dem es nicht pathogene Antigene toleriert und gleichzeitig angemessen auf pathogene Antigene^1,2reagiert. Wenn das Gleichgewicht von Toleranz und Verteidigung gestört ist, können lokalisierte oder systemische Immundysregulation und Entzündungen auftreten, was zu einer Vielzahl von Krankheiten^1,2,3führt.

Der Darm beherbergt mindestens 70% aller Lymphzellen im Körper⁴. Die meisten primären immunologischen Wechselwirkungen umfassen mindestens eine von drei Immunstationen im Darm: 1) Peyer es Patches, 2) Intraepitheliale Lymphozyten (IEL) und 3) Lamina propria Lymphozyten (LPL). Jeder von ihnen besteht aus einem komplexen vernetzten Netzwerk von Immunzellen, die schnell auf normale Immunherausforderungen im Darm reagieren⁵. Beschränkt auf die Stroma über der Muskulatur, ist die lose strukturierte Lamina propria das Bindegewebe der Darmschleimhaut und umfasst Gerüste für den Villus, die Vaskulatur, Lymphdrainage und das Mukosalnervensystem sowie viele angeborene und adaptive Immun-Teilmengen^6,7,8,9. LPL bestehen aus CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen in einem ungefähren Verhältnis von 2:1, Plasmazellen und myeloischen Abstammungszellen einschließlich, dendritischen Zellen, Mastzellen, Eosinophilen und Makrophagen⁶.

Es gibt ein wachsendes Interesse am Verständnis der Immundysregulation und Entzündung des Darms, wie es zu verschiedenen Krankheitszuständen betrifft. Solche Bedingungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa manifestieren alle unterschiedliche Konzentrationsniveaus der Darmentzündung^10,11,12. Darüber hinaus können Patienten mit bösartigen oder nicht-bösartigen Erkrankungen des Markoder Immunsystems, die sich einer allogenen Knochenmarktransplantation (allo-BMT) unterziehen, verschiedene Formen der Kolitis entwickeln, einschließlich 1) direkte Toxizität durch Konditionierungsschemas vor BMT, 2) Infektionen, die durch Immunsuppression nach BMT und 3) Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD) verursacht werden, die von Spender-Typ-T-Zellen angetrieben werden, die auf Spender-Allo-Antigene im Gewebe nach BMT^13,14,15reagieren. Alle diese Post-BMT-Komplikationen führen zu signifikanten Veränderungen im Immunmilieu des Darms^16,17,18. Die vorgeschlagene Methode ermöglicht eine zuverlässige Beurteilung der Immunzellakkumulation im Mausdoppel und ermöglicht, wenn sie auf murine Empfänger nach BMT angewendet wird, einen effizienten Test sowohl der Spender- als auch der Empfängerimmunzellen, die an der Transplantationstoleranz beteiligt sind^{19 ,20}. Weitere Ursachen für Darmentzündungen sind Bösartige Erkrankungen, Lebensmittelallergien oder Störungen des Darmmikrobioms. Dieses Protokoll ermöglicht den Zugang von Darm mononukleären Zellen aus dem Dickdarm und, mit Modifikationen, zu Leukozyten des Dünndarms in einem dieser präklinischen murine Modelle.

Eine PubMed-Suche mit dem Suchbegriff “Darm UND Immunzelle UND Isolation” zeigt über 200 Publikationen, die Methoden zur Dünndarmverdauung zur Extraktion von Immunzellen beschreiben. Eine ähnliche Literatursuche nach Dickdarm ergibt jedoch keine gut abgegrenzten Protokolle, die die Isolierung von Immunzellen vom Dickdarm angeben. Dies kann daran liegen, dass der Dickdarm mehr muskel- und interstitielle Schichten hat, was es schwieriger macht, vollständig zu verdauen als der Dünndarm. Im Gegensatz zu bestehenden Protokollen verwendet dieses Protokoll speziell Collagenase E von Clostridium histolyticum ohne andere bakterielle Kollagene (Collagenase D/ Collagenase I). Wir zeigen, dass mit diesem Protokoll die Verdauung des Kolongewebes unter Beibehaltung der Qualität isolierter mononukleärer Darmimmunzellen (MNC) ohne Zugabe von antiklumpenden Reagenzien wie Natriumversenat (EDTA), Dispase II und Desoxyribonuklease I (DNAse I)^21,22,23. Dieses Protokoll ist optimiert, um eine reproduzierbare robuste Extraktion von lebensfähigem MNC aus dem murinen Dickdarm für weitere gerichtete Studien zu ermöglichen und sollte sich für die Untersuchung der Immunologie des Dickdarms oder (mit Modifikationen) des Dünndarms²⁴ , ²⁵.