Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı
Summary
İn vitro hücre invazyonu assay, protein matrisini içeren hücre kültürü eklemlerini kullanarak invazyon ve göç için hücresel potansiyelin ölçülmesi ile kanser metastifinin potansiyelini ölçmek için kullanılır. Hücreler protein matrisinde ve gözenekli membrandan, bir kemoçekiciye doğru göç etmek ve sonra ışık mikroskobu ile ölçülebilir.
Abstract
İn vitro invazyon assay bir Boyden odasında bir protein açısından zengin matris kullanır ve kanser hücresi metastani ilk adımlarına benzer bir süreçte matris ve gözenekli bir membran geçmesine kültürlü hücrelerin yeteneğini ölçmek için. Test edilen hücreler, gen ifadesi için değiştirilebilir veya invazyon potansiyelinin değişikliklerini test etmek için inhibitörler ile tedavi edilebilir. Bu deney, hücre istilasını teşvik eden potansiyel onkogenleri keşfetmek ve karakterize etmek için fare meme tümör hücrelerinin agresif fenotipini sınar. Ancak bu teknik çok yönlü olabilir ve birçok farklı uygulamaya adapte edilebilir. Deney bir gün içinde yapılabilir ve sonuçlar ışık mikroskobu tarafından bir günden az bir sürede elde edilir. Sonuçlar, karşılaştırma ve analiz için işgalci hücrelerin sayısının sayılarını içerir. İn vitro invazyon assay, daha önce daha fazla yer alan vivo assays olarak ilk değerlendirme olarak kullanılabilecek bir kültürde hücre davranışını belirlemek için hızlı, ucuz ve net kesilmiş bir yöntemdir.
Introduction
İn vitro invazyon tahlil bir hücre yeteneğini bir protein kaplı membran üzerinden göç için ölçüm yaparken yararlı bir araç olabilir, metasjen ilk adımlara benzer. Malign kanser hücrelerinin önemli bir özelliği yoluyla göç ve yakın dokularda istila yeteneğidir. Yayılan veya metaslenmiş kanser daha fazla tedavi zorlukları pozlar ve uzun vadeli hayatta kalma düşük oranlar vardır, lokalize tümörlerin tedavisinde daha kolay ve uzun vadeli hayatta kalma yüksek oranlar var. Metassel için, kanser hücrelerinin primer tümör bırakmak ve dolaşım veya lenfatik sisteme göç gerekir, ekstrasellüler matris ve Bodrum membranı üzerinden geçen gerektiren bir süreç1. Epitelyal mezenkimal geçiş (EMT) denilen süreçte, tümör hücreleri hücre-hücre temaslarını kırmalı, yön geçirmeli ve yakındaki kan veya lenf damarlarını işgal etmelidir. Bu adımlar kanser ölümcül yapabilir ne olduğundan bu metastaf Cascade ilk adımlar büyük ilgi vardır. Metastakların erken adımlarında yer alan genetik ve epigenetik faktörler, büyük miktarda araştırmanın odağı olmaktadır, ancak bu erken adımları hem in vivo hem de vitro olarak test etmek için doğru ve güvenilir deneysel araçlar gereklidir.
Yara iyileşmesi (çizik) gibi hücre göç değişiklikleri ölçmek için araçlar veya Soft agar gibi 3D ortamlarda büyüme kısmen metastazın erken adımlarını ölçmek için deneysel yöntemler ihtiyacını ele alabilir, ama bir tahlil invazyonu ölçmek için karmaşık bir tümör mikroçevre içinde vücutta meydana beri daha zorlu. İnvazyon ve metastaz açısından önemli faktörleri belirlemek için ilaçların veya gen değişikliklerinin taranması amacıyla, kültürlü hücrelerle içinde vitro olarak kullanılabilecek bir sistem ve in vivo metastatik hücrelerin karşılaştığı zorlukları taklit eden invazif tahlil2, 3‘ ü yapın. Meme kanseri kadınlarda kanser en sık teşhis türü ve kadınlarda kanser ölümü ikinci önde gelen nedeni, bu yüzden meme kanseri hücre invazyonu ve metastatik sorumlu genler anlayış kamu sağlığı için kritik öneme sahiptir. Dahası, fare hücreleri meme kanseri ve ilerlemesini incelemek için yararlı bir model sistemidir.
İn vitro invazyon tahlil iki büyüme medya odaları gözenekli bir membran ile ayrılır Boyden odası montaj dayanmaktadır3. Tümör mikroortamını taklit etmek için, bir oda içindeki hücreleri diğer bir kemoatraktan ‘dan ayıran ve bir Bodrum membran bariyeri olarak hareket eden protein bakımından zengin bir jel de dahil edilir. Chemoattractant doğru göç etmek için, hücreler önce protein açısından zengin bariyer geçmesi gerekir sonra gözenekli membran geçmesi-metastatik hücrelerin stroma üzerinden göç nasıl benzer bir süreç. Protein açısından zengin jel denemenin ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir, ancak genellikle kollajen veya Bodrum membran ekstresi oluşur (örneğin, Matrigel)4. Bu proteinler, proteoglikanlar ve büyüme faktörlerinin karmaşık bir karışımıdır, ancak çoğunlukla lamininlerin ve kollajen IV 4,5oluşur. Hücreler daha sonra genellikle polikarbonat, polyester, veya Politetrafloroetilen (PTFE) yapılmış bir gözenekli membran geçmesi gerekir. Membranlar, bir protein jeli (genellikle collagens) ile veya olmadan ticari olarak satın alınabilir veya jel ayrı olarak satın alınabilir ve eklenebilir. Gözenek boyutu hücre boyutuna göre ayarlanabilir. Gözenek boyutları 0,4-8,0 μm ‘ den itibaren kullanılabilir durumdayken, sadece 3,0-8,0 μm ‘ den gelen gözenekler hücre göçü için yeterince büyüktür. İstila tahlil, hücrelerin göç ve istila yeteneğine karşı inhibitörlerinin etkinliğini belirlemek için kullanılmıştır. İçinde bulunan tam tümör mikroçevre eksik iken Vivo, in vitro invazyon tahlil hayvan modelleri için ihtiyaç minimize ederken kısa bir süre içinde birçok koşul tarama yararlıdır. Bu deneylerin amacı, şüpheli onkogenler gen ifadesi karşılaştırmak ve kanser hücresi davranış ve hastalık saldırganlık içinde vitro invazyon tahlil ve diğer testleri kullanarak etkilerini belirlemek için. Genel olarak, invazif tahlil, nispeten ucuz, basit ve uyarlanabilir bir yöntem olmakla beraber metastatik potansiyeli belirlemek için tutarlı, nicel ve hızlı sonuçlar sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
İn vitro invazif tahlil, kanser hücresi istilasını teşvik eden faktörleri incelemek için ucuz, hızlı, nicel ve basit bir yöntemdir. Meme kanseri kadınlar arasında en sık teşhis edilen kanserdir. Meme kanseri üç büyük alt türleri, Üçlü negatif, (veya ER-, PR-, HER2/Neu-), en agresif, en metasrat ve en ölümcül9muhtemeldir. Bu nedenle, metastatik sonuca neden olan genler ve ifadeyi anlamak, hastalığın yeni terapötik hedeflerini ve genetik belirteçlerini bulmanı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri ‘nden Grant R15CA169978 tarafından destekleniyordu. Villanova Üniversitesi ‘nden ek finansman geldi.
Materials
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y. Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion. Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
