L'uso di cellule tumorali mammarie del topo in un saggio di invasione in vitro come misura del comportamento cellulare oncogeno

Il saggio di invasione in vitro può essere uno strumento utile quando si misura la capacità di una cellula di migrare attraverso una membrana rivestita di proteine, analoga ai primi passi nella metastasi. Una caratteristica chiave delle cellule tumorali maligne è la loro capacità di migrare attraverso e invadere i tessuti vicini. Il cancro che si è diffuso o metastatizzato pone più sfide di trattamento e ha tassi più bassi di sopravvivenza a lungo termine, mentre i tumori localizzati sono più facili da trattare e hanno tassi più elevati di sopravvivenza a lungo termine. Per metastatizzare, le cellule tumorali devono lasciare il tumore primario e migrare nel sistema circolatorio o linfatico, un processo che richiede il passaggio attraverso la matrice extracellulare e la membrana seminterrato¹. Nel processo chiamato transizione epiteliale mesenchymal (EMT), le cellule tumorali devono rompere i contatti delle cellule cellulari, migrare direzionalmente e invadere i vasi sanguigni o linfatici vicini. I primi passi di questa cascata di metastasi sono di grande interesse poiché questi passaggi sono ciò che può rendere il cancro più letale. I fattori genetici ed epigenetici coinvolti nelle prime fasi della metastasi sono al centro di una grande quantità di ricerca, ma sono necessari strumenti sperimentali accurati e affidabili per testare questi primi passi sia in vivo che in vitro.

Gli strumenti per misurare i cambiamenti nella migrazione cellulare come i saggi di guarigione delle ferite (graffio) o la crescita in ambienti 3D come i test di agar morbido possono affrontare parzialmente la necessità di metodi sperimentali per misurare i primi passi della metastasi, ma un saggio per misurare l’invasione è più impegnativo dal momento che il processo si verifica nel corpo all’interno di un complesso microambiente tumorale. Ai fini dello screening di farmaci o alterazioni genetiche per determinare fattori importanti nell’invasione e nella metastasi, un sistema che può essere utilizzato in vitro con cellule coltivate e imitare le sfide affrontate dalle cellule metastatiche in vivo è il saggio di invasione^{2, 3}. Il cancro al seno è il tipo di cancro più comunemente diagnosticato nelle donne e la seconda causa di morte per cancro nelle donne, quindi comprendere i geni responsabili dell’invasione delle cellule tumorali e delle metastasi è di fondamentale importanza per la salute pubblica. Inoltre, le cellule del topo sono un utile sistema modello per studiare il cancro al seno e la sua progressione.

Il saggio di invasione in vitro si basa sull’assemblea della Camera di Boyden, dove due camere di mezzo di crescita sono separate da una membrana porosa³. Per imitare il microambiente tumorale, un gel ricco di proteine è incluso anche per separare le cellule in una camera da un chemioattraente nell’altra e agire come una barriera di membrana seminterrato. Per migrare verso il chemioattraente, le cellule devono prima passare attraverso la barriera ricca di proteine e poi passare attraverso la membrana porosa – un processo analogo a come le cellule metastatiche migrano attraverso lo stroma. Il gel ricco di proteine può essere modificato in base alle esigenze dell’esperimento, ma di solito è costituito da collagene, o estratto di membrana seminterrato (ad esempio, Matrigel)⁴. È una complessa miscela di proteine, proteoglicani e fattori di crescita, ma per lo più è costituito da laminoine e collagene IV ^4,5. Le cellule devono quindi passare attraverso una membrana porosa tipicamente in policarbonato, poliestere o politetrafluoroetilene (PTFE). Le membrane possono essere acquistate commercialmente con o senza un gel proteico (tipicamente collagene), oppure il gel può essere acquistato separatamente e aggiunto. La dimensione del poro può essere regolata in base alle dimensioni della cella. Mentre le dimensioni dei pori sono disponibili da 0,4 – 8,0 m, solo i pori da 3,0 a 8,0 m sono abbastanza grandi per la migrazione cellulare. Il saggio di invasione è stato utilizzato per determinare l’efficacia degli inibitori sulla capacità delle cellule di migrare e invadere. Pur mancando l’esatto microambiente tumorale presente in vivo, il test dell’invasione in vitro è utile per lo screening di molte condizioni in breve tempo riducendo al minimo la necessità di modelli animali. L’obiettivo di questi esperimenti è confrontare l’espressione genica di oncogeni sospetti e determinare gli effetti sul comportamento delle cellule tumorali e sull’aggressività della malattia usando il saggio di invasione in vitro e altri test. Nel complesso, il test di invasione fornisce risultati coerenti, quantitativi e rapidi per determinare il potenziale metastatico, pur essendo un metodo relativamente economico, semplice e adattabile.