Die Verwendung von Maus-Mammary-Tumorzellen in einem In-Vitro-Invasions-Assay als Maß für das onkogene Zellverhalten

Der In-vitro-Invasionstest kann ein nützliches Werkzeug bei der Messung der Fähigkeit einer Zelle sein, durch eine proteinbeschichtete Membran zu wandern, analog zu den ersten Schritten in der Metastasierung. Ein Schlüsselmerkmal bösartiger Krebszellen ist ihre Fähigkeit, durch nahegelegene Gewebe zu wandern und einzudringen. Krebs, der sich ausgebreitet oder metastasiert hat, stellt mehr Behandlungsherausforderungen dar und hat niedrigere Raten des langfristigen Überlebens, während lokalisierte Tumoren leichter zu behandeln sind und höhere Raten des langfristigen Überlebens haben. Um metastasieren zu können, müssen Krebszellen den Primärtumor verlassen und in das Kreislauf- oder Lymphsystem wandern, ein Prozess, der den Übergang durch die extrazelluläre Matrix und Kellermembran¹erfordert. Dabei müssen die Tumorzellen, die als epithelialer mesenchymaler Übergang (EMT) bezeichnet werden, Zellzellkontakte brechen, richtungsweisend migrieren und in nahegelegene Blut- oder Lymphgefäße eindringen. Die ersten Schritte dieser Metastasenkaskade sind von großem Interesse, da diese Schritte Krebs tödlicher machen können. Die genetischen und epigenetischen Faktoren, die an den frühen Schritten der Metastasierung beteiligt sind, stehen im Mittelpunkt einer großen Menge an Forschung, aber es sind genaue und zuverlässige experimentelle Werkzeuge erforderlich, um diese frühen Schritte sowohl in vivo als auch in vitro zu testen.

Werkzeuge zur Messung von Veränderungen in der Zellmigration wie Wundheilung (Kratz-)Assays oder Wachstum in 3D-Umgebungen wie Soft Agar Assays können teilweise die Notwendigkeit experimenteller Methoden zur Messung früher Metastasierungsschritte decken, aber ein Test zur Messung der Invasion ist schwieriger, da der Prozess im Körper in einer komplexen Tumormikroumgebung stattfindet. Für das Screening von Medikamenten oder Genveränderungen, um wichtige Faktoren bei Invasion und Metastasierung zu bestimmen, ist ein System, das in vitro mit kultivierten Zellen verwendet werden kann und die Herausforderungen nachahmt, denen metastasierende Zellen in vivo gegenüberstehen, der Invasionstest^{2, 3}. Brustkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebsart bei Frauen und die zweithäufigste Krebstodesursache bei Frauen, daher ist das Verständnis der Gene, die für die Invasion von Brustkrebszellen und Metastasen verantwortlich sind, von entscheidender Bedeutung für die öffentliche Gesundheit. Darüber hinaus sind Mauszellen ein nützliches Modellsystem zur Untersuchung von Brustkrebs und dessen Fortschreiten.

Der In-vitro-Invasionstest basiert auf der Boyden Chamber Assembly, wo zweiKammern von Wachstumsmedien durch eine poröse Membran 3 getrennt sind. Um die Tumormikroumgebung nachzuahmen, ist ein proteinreiches Gel auch enthalten, um Zellen in einer Kammer von einem Chemoattractant in der anderen zu trennen und als Kellermembranbarriere zu fungieren. Um zum Chemoattractant zu wandern, müssen die Zellen zuerst die proteinreiche Barriere passieren und dann die poröse Membran passieren – ein Prozess, der der Art und Weise entspricht, wie metastasierende Zellen durch Stroma wandern. Das proteinreiche Gel kann je nach den Erfordernissen des Experiments verändert werden, besteht aber in der Regel aus Kollagen oder Kellermembranextrakt (z.B. Matrigel)⁴. Es ist eine komplexe Mischung aus Proteinen, Proteoglykanen und Wachstumsfaktoren, besteht aber hauptsächlich aus Lamininen und Kollagen IV ^4,5. Die Zellen müssen dann eine poröse Membran passieren, die typischerweise aus Polycarbonat, Polyester oder Polytetrafluorethylen (PTFE) besteht. Membranen können kommerziell mit oder ohne Proteingel (typischerweise Kollagene) oder das Gel separat erworben und hinzugefügt werden. Die Porengröße kann basierend auf der Zellgröße angepasst werden. Während Porengrößen von 0,4 – 8,0 m erhältlich sind, sind nur Poren von 3,0 – 8,0 m groß genug für die Zellmigration. Der Invasionstest wurde verwendet, um die Wirksamkeit von Inhibitoren auf die Fähigkeit der Zellen zu migrieren und einzudringen zu bestimmen. Obwohl die genaue Tumor-Mikroumgebung fehlt, die in vivo vorhanden ist, ist der In-vitro-Invasionstest vorteilhaft beim Screening vieler Bedingungen in kurzer Zeit und minimiert gleichzeitig den Bedarf an Tiermodellen. Das Ziel dieser Experimente ist es, die Genexpression vermuteter Onkogene zu vergleichen und die Auswirkungen auf das Verhalten von Krebszellen und die Aggressivität von Krankheiten mithilfe des In-vitro-Invasionstests und anderer Tests zu bestimmen. Insgesamt liefert der Invasionstest konsistente, quantitative und schnelle Ergebnisse zur Bestimmung des metastasierenden Potenzials und ist gleichzeitig eine relativ kostengünstige, unkomplizierte und anpassungsfähige Methode.