KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan
Summary
Biz situ hibridizasyon floresan kullanan bir protokol tarif (FISH) lytically enfekte insan hücrelerinin içinde birden fazla herpesviral RNA görselleştirmek için, süspansiyon veya yapışık. Bu protokol, nükleositoplazmik oran üreten floresan ların niceliğini içerir ve konak ve viral proteinlerin immünoresans (IF) ile eşzamanlı olarak görüntülenmesi için uzatılabilir.
Abstract
Mekanistik içgörü dikkatli çalışma ve belirli RNA ve proteinlerin niceliksel gelir. Bu biyomoleküllerin belirli zamanlarda hücre boyunca göreceli konumları, yerinde hibridizasyon (FISH) ve immünofloresan (IF) floresan ile yakalanabilir. Litik herpesvirüs enfeksiyonu sırasında, virüs tercihen viral genleri ifade etmek için konak hücre kaçırArak hücre morfolojisi ve biyomoleküllerin davranış değişikliklerine neden. Litik faaliyetler nükleer fabrikalarda, viral çoğaltma bölmeleri olarak adlandırılan ve sadece FISH ve IF ile ayırt edilebilen merkezler. Burada Kaposi sarkomu ile ilişkili herpesvirus (KSHV) enfekte hücreleri için RNA FISH ve IF teknikleri nin uyarlanabilir bir protokolünü açıklıyoruz, hem yapışık hem de süspansiyon. Yöntem, spesifik anti-duyu oligonükleotidlerin, çift RNA FISH, IF ile RNA FISH ve floresan yoğunluklarının nicel hesaplamalarının geliştirilmesi için gerekli adımları içerir. Bu protokol, birden fazla hücre tipine, enfekte olmayan hücrelere, gizli hücrelere, litik hücrelere, zaman-kurslara ve inhibitörlerle tedavi edilen hücrelere, hem insan konakından hem de insan konakçısından gelen spesifik RNA’ların ve proteinlerin spatiotemporal aktivitelerini analiz etmek için başarıyla uygulanmıştır. KSHV.
Introduction
Litik (aktif) fazlarında, herpesvirüsler konak hücreyi kaçırArak hücre morfolojisinde ve biyolojik moleküllerin lokalizasyonunda değişikliklere yol açarak virions üretirler. Operasyonların temeli çekirdektir, burada çift iplikli DNA viral genomu çoğaltılır ve bir protein kabuğuna paketlenir, capsid1olarak adlandırılır. Başlamak için, virüs kendi proteinlerini ifade eder, konak makine kaçırma ve gerekli olmayan konak genlerin ifade sini önleme, bir süreç konak kapatma etkisi olarak adlandırDı. Bu aktivitenin çoğunluğu belirli lokalize 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI)-ücretsiz nükleer bölgeler viral çoğaltma bölmeleri olarak adlandırılan, hem konak ve viral proteinler oluşan, RNA, ve viral DNA2. Hücre çoğaltma bölmeleri ve böylece viral capsids montajı için yer ve kaynak sağlamak için elden geçirilir. Kapsid çekirdekten çıktıktan sonra, kapsidin sitoplazmada nasıl sarsılmış olduğu, virion olarak da bilinen zara bağlı viral parçacık lar ürettiği belirsizdir. Litik fazda hem konak hem de viral biyomoleküllerin lokalizasyonu ve mekansal kaymalarının anlaşılması, çoğaltma bölmesinin düzenlenmesi, konak kapatma etkisi, virion-çıkış yolu ve diğer herpesviral enfeksiyon ve replikasyon ile ilgili süreçler.
Şu anda bu değişiklikleri tespit etmek ve incelemek için en iyi yöntem, sırasıyla immünfloresansan (IF) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile enfekte hücrelerde protein ve RNA görselleştirme olduğunu. Bu tekniklerle bir zaman-ders kullanımı litik faz ın önemli noktalarında biyomoleküllerin lokalizasyonunu ya da basitçe, spatiotemporal verileri ortaya çıkarır. FISH ve IF, hücresel sürecin inhibisyonu (örn. viral DNA replikasyonunun inhibisyonu), RT-qPCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu), RNA sıralama, Kuzey lekeleri, kütle spektrometresi, Batı lekeleme ve hücresel faaliyetlerin daha küresel bir resim sağlayabilir viral DNA üretiminin analizi.
RNA ürünlerini belirli genlerden incelemek için RNA FISH stratejileri ve belirli bir gen ürününün nükleositoplazmik oranını nicel olarak hesaplayan bir hesaplama analizi geliştirdik. Örnek hazırlama, Steitz ve meslektaşları tarafından önceki yayınlardan modifiye3,4, nispeten kolay ve hem yapışık ve askıda hücreler için kullanılabilir. Protokol aynı zamanda birden fazla RNA FISH stratejilerinin (çift RNA FISH) veya IF stratejileri ile RNA FISH’in eşzamanlı kullanımı için de uyarlanabilir. Belirli bir FISH stratejisinin geliştirilmesi zordur, ancak başarıyı artırmak için öneriler özetlenmiştir. Burada açıklanan veri analizi, floresan boncuklar ve bölme sınırlarının güçlü belirteçleri kullanılıyorsa niceldir ve mikrograflar, gözlem önyargısını ortadan kaldıran içgörü hakkında ek bilgiler sunar. Ayrıntılı protokol Kaposi sarkomu ile ilişkili herpesvirus (KSHV) tarafından enfekte hem gizli hem de litik hücreler için tasarlanmıştır ve diğer herpesviruses tarafından enfekte olmayan hücreler veya hücreler ile kullanılabilir5. Sayısallaştırma yöntemleri, çoğu hücredeki hücre altı bölmeler arasında nükleositoplazmik kaymalar veya yeniden lokalizasyon çalışmaları için geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporda açıklanan protokol farklı hücre tiplerine uyarlanabilir ve çift RNA FISH ve RNA FISH için hem monoklonal hem de poliklonal primer antikorlar kullanılarak adımlarını içerir. Hazırlanan slaytlar genellikle konfokal mikroskop ile görüntülense de, artmış antikor konsantrasyonu ve farklı montaj ortamı modifikasyonları yapıldıktan sonra sted (uyarılmış emisyon tükenmesi) mikroskopile görüntüleme yapılabilir. Bireysel hücrelerin gelişmiş analizi için, bu protokol ile hazırlanan örn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz veri analizi konusunda tavsiye için Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski ve Johanna B. Withers teşekkür ederiz. Ayrıca G. Hayward’a anti-SSB antikorları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (TKV’ye) ve NIH hibe (CA16038) (JAS’e) T32GM007223 ve T32AI055403 hibeleri ile desteklenmiştir. JAS, Howard Hughes Tıp Enstitüsü’nün bir araştırmacısı. Şekil 1-3 ve Tablo 1 Aşağıdaki yayından Creative Commons Atıf lisansı altında Amerikan Mikrobiyoloji Derneği izni ile çoğaltıldı: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi’s Sarcoma-Associated Nükleer Foci Herpesvirus mRNA Birikimi Viral DNA Replikasyonu ve Viral Noncoding Polyadenylated Nükleer RNA etkilenir. Viroloji Dergisi. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).
Materials
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
References
- Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
- Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
- Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
- Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi’s sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
- Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi’s sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
- Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
- Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
- Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
- Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
- Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).
