פלואורסצנטית כמותי באתרו היברידיזציה (דג) ו Immunofluorescence (IF) של מוצרים גנטיים ספציפיים בתאים שנדבקו KSHV
Summary
אנו מתארים פרוטוקול ניצול הקרינה היברידיזציה באתרו (דג) כדי להמחיש RNAs מרובים של הרפס בתוך תאים אנושיים נגועים ליקיה, או בהשעיה או חסיד. פרוטוקול זה כולל כימות של זריחה המייצרת יחס נוקלאוציטוסמטי וניתן להארכה להדמיה סימולטני של חלבונים מארחים ונגיליים עם immunofluorescence (IF).
Abstract
תובנה מכניסטית מגיעה מלמידה קפדנית ומקוונפיקציה של RNAs וחלבונים ספציפיים. המיקומים היחסיים של biomolecules אלה ברחבי התא בזמנים ספציפיים יכולים להילכד עם אור היברידיזציה באתרו (דג) ו immunofluorescence (IF). במהלך זיהום וירוס lytic, הנגיף מעורר את התא המארח כדי להיות מעדיפים לבטא גנים ויראליים, גרימת שינויים במבנה התא והתנהגות של biomolecules. פעילויות lytic ממורכזים במפעלים גרעיניים, כינה תאי שכפול ויראלי, אשר ניתן להבחין רק עם דגים ו IF. כאן אנו מתארים פרוטוקול הסתגלות של ה-RNA פיש, אם טכניקות עבור סרקומה של קפושי וירוס הקשורים (KSHV)-תאים נגועים, שניהם חסיד ו השעיה. השיטה כוללת שלבים להתפתחות של מחלת האנטי-סנס מסוימת, דגי RNA כפולים, דגי RNA עם IF, וחישובים כמותיים של עוצמות הזריחה. פרוטוקול זה הוחל בהצלחה על סוגי תאים מרובים, תאים לא נגוע, תאים סמויים, תאים lytic, זמן קורסים, ותאים מטופלים עם מעכבי לנתח את הפעילויות הטמפורלית של rnas וחלבונים ספציפיים מהמארח האנושי ו . לא, לא.
Introduction
בשלב lytic שלהם, הרפס לחטוף את התא המארח, גרימת שינויים במבנה התא ולוקליזציה של מולקולות ביולוגיות, כדי לייצר הריטונים. הבסיס של המבצעים הוא הגרעין, שבו הגנום כפול ויראלי DNA הוא משוכפל וארוזים לתוך קליפת חלבון, נקרא capsid1. כדי להתחיל, הווירוס מבטא חלבונים משלו, חטיפת מכונות מארח ומניעת ביטוי של גנים מארחים שאינם חיוניים, תהליך המכונה אפקט שוטוף מארח. רוב הפעילות הזאת הוא מקומי ספציפי 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-אזורים גרעיניים ללא תשלום הנקרא תאי שכפול ויראלי, מורכב הן חלבונים מארחים ויראלי, RNAs, ו-DNA נגיפי2. התא הוא מוגזם כדי לספק מרחב ומשאבים עבור תאי השכפול ובכך הרכבה של הקפידים ויראלי. ברגע שהקפסיד יוצא מהגרעין, כיצד הקפיסיד אפוף בציטופלסמה כדי לייצר חלקיק נגיפי מאוגד, הידוע גם בשם וויריאון, אינו ברור. הבנת הלוקליזציה והשינויים המרחביים של הbiomolecules המארחים והנגיפי במהלך השלב lytic מספק תובנה מכניסטית עמוקה יותר לתוך הסידור של תא השכפול, אפקט שוביטוף מארח, מסלול היציאה והמעבר, ועוד תהליכים הקשורים לזיהום ושכפול הרפס.
כיום השיטה הטובה ביותר לזהות וללמוד שינויים אלה היא ויזואליזציה של חלבונים ו-RNAs בתאים נגועים עם immunofluorescence (IF) ו פלורסנט באתרו היברידיזציה (דג), בהתאמה. שימוש בזמן-קורס עם טכניקות אלה חושף את הלוקליזציה של biomolecules בנקודות מפתח של השלב lytic או פשוט, הנתונים הזמני. דגים ואם משלימים טכניקות ביוכימיות אחרות, כגון עיכוב של תהליך הסלולר (למשל, עיכוב של שכפול ה-DNA ויראלי), RT-qpcr (תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת), רצפי RNA, בלוטים צפוניים, ספקטרומטר מסה, בלוק מערבי, ו ניתוח של ייצור ה-DNA נגיפי, כי עשוי לספק תמונה גלובלית יותר של פעילויות סלולריות.
פיתחנו את האסטרטגיות של ה-RNA לבדיקת מוצרי RNA מגנים ספציפיים ואנליזה חישובית המחשבת את היחס הנוקלאולוציציסמטי של מוצר גנטי מסוים. הכנת המדגם, שונה מפרסומים קודמים על ידי steitz ועמיתים3,4, הוא קל יחסית והוא יכול לשמש הן מחסיד והן תאים מושעה. הפרוטוקול הוא גם להתאמה לשימוש בו זמנית של מספר אסטרטגיות RNA דגים (כפול רנ א) או דג RNA עם אסטרטגיות IF. פיתוח אסטרטגיית דגים ספציפית מאתגרת, אך הצעות לשיפור ההצלחה מתוארות במיתאר. ניתוח הנתונים המתואר כאן הוא כמותי אם חרוזי פלורסנט וסמנים חזקים של גבולות תא משמשים ומציעה תובנה נוספת במיקרוגרפים, תובנה המסירה הטיית תצפית. הפרוטוקול המפורט מיועד לתאים סמויים וליטיק נגוע בווירוס הקשורות סרקומה של קפושי (KSHV) והוא יכול לשמש עם תאים לא נגועים או תאים נגועים על ידי אחרים הרפס5. שיטות הקוונלויות הינן ישימות למחקרים על משמרות נוקלאוציטוצילסמטי או לוקליזציה מחדש בין תאי משנה ברוב התאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר בדו ח זה יכול להיות מותאם לסוגי תאים שונים וכולל שלבים עבור כפול RNA פיש ו-RNA דגים עם אם באמצעות שבטים מונוניים ונוגדנים ראשוניים רב שבטיים. למרות שקופיות מוכנות הם בדרך כלל בתמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, הדמיה ניתן לבצע עם מחסור בפליטה ממריצים) לאחר שינויים של ריכוז הנו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ליונתן רוזדנלס, קז’ימייז ‘ טיקובסקי ו ג’ואנה ב. ווית לקבלת ייעוץ בנוגע לניתוח נתונים. אנו גם מודים לג הייוורד. על נוגדן האנטי-SSB עבודה זו נתמכת על ידי מענקים T32GM007223 ו T32AI055403 מן המכונים הלאומיים לבריאות (ל TKV) ו-NIH מענק (CA16038) (כדי JAS). JAS הוא חוקר של המכון הרפואי הווארד יוז. איורים 1-3 ושולחן 1 שוחזרו באישור החברה האמריקנית למיקרוביולוגיה תחת רישיון ייחוס מלאי יצירתי מהפרסום הבא: Vallery, ט. ק., ווית, J. B., אנדו, ג’יי א., Steitz, J. א. קפוסי סרקומה של הקשורים מבנה mRNA הצטברות ב-Foci גרעינית מושפע DNA נגיפי שכפול ויראלי שאינם קידוד רב RNA גרעינית. כתב העת לוירולוגיה. 92 (13), דוי: 10.1128/jvi. 00220-18, (2018).
Materials
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
References
- Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
- Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
- Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
- Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi’s sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
- Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi’s sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
- Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
- Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
- Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
- Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
- Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).
