Fluorescence quantitative In Situ Hybridization (FISH) et Immunofluorescence (IF) de produits génétiques spécifiques dans les cellules infectées par le KSHV

Dans leur phase lytique (active), les herpèsvirus détournent la cellule hôte, provoquant des changements dans la morphologie cellulaire et la localisation des molécules biologiques, pour produire des virions. La base des opérations est le noyau, où le génome viral de l’ADN à double brin est reproduit et emballé dans une coquille de protéine, appelée capside¹. Pour commencer, le virus exprime ses propres protéines, détournant les machines hôtes et empêchant l’expression de gènes hôtes non essentiels, un processus appelé l’effet d’arrêt de l’hôte. La majorité de cette activité est localisée dans des régions nucléaires spécifiques, exemptes de réplication virale, composées de protéines hôtes et virales, d’ARNet d’ADN viral 2. La cellule est révisée pour fournir de l’espace et des ressources pour les compartiments de réplication et donc l’assemblage de capsides virales. Une fois que la capsite sort du noyau, la façon dont la capside est enveloppée dans le cytoplasme pour produire une particule virale liée à la membrane, également connue sous le nom de virion, n’est pas claire. La compréhension de la localisation et des changements spatiaux des biomolécules hôtes et virales pendant la phase lytique fournit un aperçu mécaniste plus profond de l’arrangement du compartiment de réplication, de l’effet d’arrêt de l’hôte, de la voie d’évacuation des virions et d’autres processus liés à l’infection et à la réplication de l’herpèsviral.

Actuellement, la meilleure méthode pour détecter et étudier ces changements est la visualisation des protéines et des ARN dans les cellules infectées avec immunofluorescence (IF) et l’hybridation in situ fluorescente (FISH), respectivement. L’utilisation d’un cours de temps avec ces techniques révèle la localisation des biomolécules à des points clés de la phase lytique ou tout simplement, des données spatiotemporales. FISH et IF complètent d’autres techniques biochimiques, telles que l’inhibition d’un processus cellulaire (p. ex., inhibition de la réplication virale de l’ADN), RT-qPCR (réaction en chaîne de polymérase en temps réel), séquençage de l’ARN, taches nordiques, spectrométrie de masse, ballonnements occidentaux et l’analyse de la production d’ADN viral, qui peut fournir une image plus globale des activités cellulaires.

Nous avons développé des stratégies RNA FISH pour examiner les produits à base d’ARN à partir de gènes spécifiques et une analyse computationnelle qui calcule quantitativement le rapport nucléocytoplasmique d’un produit génétique spécifique. La préparation de l’échantillon, modifiée à partir de publications antérieures par Steitz et ses collègues^3,4, est relativement facile et peut être utilisé pour les cellules adhérentes et suspendues. Le protocole est également adaptable pour l’utilisation simultanée de plusieurs stratégies ARN FISH (double ARN FISH) ou RNA FISH avec des stratégies IF. L’élaboration d’une stratégie FISH spécifique est difficile, mais des suggestions pour améliorer le succès sont esquissées. L’analyse des données décrite ici est quantitative si des perles fluorescentes et des marqueurs solides des limites des compartiments sont utilisés et offre un aperçu supplémentaire des micrographes, un aperçu qui élimine les biais d’observation. Le protocole détaillé est conçu pour les cellules latentes et lytiques infectées par l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV) et peut être utilisé avec des cellules non infectées ou des cellules infectées par d’autres herpèsvirus⁵. Les méthodes de quantitation s’appliquent aux études sur les décalages nucléocytoplasmiques ou la relocalisation entre les compartiments subcellulaires dans la plupart des cellules.