Fluorescencia cuantitativa en hibridación situ (FISH) e inmunofluorescencia (IF) de productos genéticos específicos en células infectadas por KSHV
Summary
Describimos un protocolo que utiliza la hibridación in situ por fluorescencia (FISH) para visualizar múltiples ARN herpesvirales dentro de células humanas infectadas lyéticamente, ya sea en suspensión o adherente. Este protocolo incluye la cuantificación de la fluorescencia produciendo una relación nucleocitotoplasmática y se puede extender para la visualización simultánea de proteínas huésped y virales con inmunofluorescencia (IF).
Abstract
La visión mecanicista proviene de un estudio cuidadoso y la cuantificación de ARN y proteínas específicas. Las ubicaciones relativas de estas biomoléculas en toda la célula en momentos específicos se pueden capturar con hibridación in situ por fluorescencia (FISH) e inmunofluorescencia (IF). Durante la infección por herpesvirus lítico, el virus secuestra la célula huésped para expresar preferentemente genes virales, causando cambios en la morfología celular y el comportamiento de las biomoléculas. Las actividades líticas se centran en fábricas nucleares, denominadas compartimentos de replicación viral, que sólo son discernibles con FISH y IF. Aquí describimos un protocolo adaptable de las técnicas de ARN FISH y IF para las células infectadas por el herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV), tanto adherentes como en suspensión. El método incluye pasos para el desarrollo de oligonucleótidos específicos antisentido, DOBLE ARN FISH, RNA FISH con IF y cálculos cuantitativos de intensidades de fluorescencia. Este protocolo se ha aplicado con éxito a múltiples tipos de células, células no infectadas, células latentes, células líticas, cursos de tiempo y células tratadas con inhibidores para analizar las actividades espaciotemporales de ARN y proteínas específicos tanto del huésped humano como de Kshv.
Introduction
En su fase lítica (activa), los herpesvirus secuestran la célula huésped, causando cambios en la morfología celular y la localización de moléculas biológicas, para producir viriones. La base de las operaciones es el núcleo, donde el genoma viral del ADN de doble cadena se replica y empaqueta en una cáscara de proteína, llamada cápside1. Para empezar, el virus expresa sus propias proteínas, secuestrando maquinaria huésped y previniendo la expresión de genes de host no esenciales, un proceso llamado efecto de cierre del huésped. La mayor parte de esta actividad se localiza en regiones nucleares específicas libres de 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)llamadas compartimentos de replicación viral, compuestos por proteínas huésped y virales, ARN y ADN viral 2. La célula se revisa para proporcionar espacio y recursos para los compartimentos de replicación y, por lo tanto, el montaje de cápsides virales. Una vez que la cápside sale del núcleo, no está claro cómo la cápside está envuelta en el citoplasma para producir una partícula viral ligada a la membrana, también conocida como virión. La comprensión de la localización y los cambios espaciales de las biomoléculas víricas y del huésped durante la fase lítica proporciona una visión mecanicista más profunda de la disposición del compartimiento de replicación, el efecto de cierre del host, la vía de virión-salida y otros procesos relacionados con la infección y replicación del herpesviral.
Actualmente el mejor método para detectar y estudiar estos cambios es la visualización de proteínas y ARN en células infectadas con inmunofluorescencia (IF) e hibridación fluorescente in situ (FISH), respectivamente. El uso de un curso de tiempo con estas técnicas revela la localización de biomoléculas en puntos clave de la fase lítica o, simplemente, datos espaciotemporales. FISH y IF complementan otras técnicas bioquímicas, como la inhibición de un proceso celular (por ejemplo, la inhibición de la replicación del ADN viral), RT-qPCR (reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real), la secuenciación de ARN, las manchas del norte, la espectrometría de masas, la hinchazón occidental y análisis de la producción de ADN viral, que puede proporcionar una imagen más global de las actividades celulares.
Desarrollamos estrategias de ARN FISH para examinar los productos de ARN a partir de genes específicos y un análisis computacional que calcula cuantitativamente la relación nucleocitotoplasmática de un producto genético específico. La preparación de la muestra, modificada a partirde publicaciones anteriores de Steitz y sus colegas 3,4, es relativamente fácil y se puede utilizar tanto para células adherentes como suspendidas. El protocolo también es adaptable para el uso simultáneo de múltiples estrategias de ARN FISH (doble ARN FISH) o RNA FISH con estrategias IF. El desarrollo de una estrategia específica de FISH es un reto, pero se describen sugerencias para mejorar el éxito. El análisis de datos descrito aquí es cuantitativo si se utilizan cuentas fluorescentes y marcadores fuertes de los límites del compartimiento y ofrece información adicional sobre las micrografías, información que elimina el sesgo de observación. El protocolo detallado está diseñado tanto para células latentes como líticas infectadas por el herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV) y se puede utilizar con células no infectadas o células infectadas por otros herpesvirus5. Los métodos de cuantificación son aplicables a estudios sobre desplazamientos nucleocitotoplásmicos o relocalización entre compartimentos subcelulares en la mayoría de las células.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito en este informe se puede adaptar a diferentes tipos de células e incluye pasos para el doble ARN FISH y el ARN FISH con IF utilizando anticuerpos primarios monoclonales y policlonales. Aunque las diapositivas preparadas se suelen crear imágenes con un microscopio confocal, las imágenes se pueden realizar con un microscopio STED (agotamiento de emisiones estimulada) después de modificaciones del aumento de la concentración de anticuerpos y un medio de montaje diferente. Para un análisis mejorad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski y Johanna B. Withers por su asesoramiento sobre el análisis de datos. También agradecemos a G. Hayward por el anticuerpo anti-SSB. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones T32GM007223 y T32AI055403 de los Institutos Nacionales de Salud (TKV) y la subvención NIH (CA16038) (a JAS). JAS es investigador del Instituto Médico Howard Hughes. Las figuras 1-3 y 1 se reprodujeron con permiso de la Sociedad Americana de Microbiología bajo una licencia Creative Commons Attribution de la siguiente publicación: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi’s Sarcoma-Associated La acumulación de ARNm de herpesvirus en foci nucleares está influenciada por la replicación del ADN viral y el ARN nuclear no denilado no codificador viral. Revista de Virología. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).
Materials
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
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