בדיקת כימות משנית אוביקוויאין-פעילות פרוטאסדום במוח מכרסם
Summary
פרוטוקול זה נועד ביעילות לכמת אוביקוויב-פרוטאסדום מערכת (UPS) פעילות בתאים סלולריים שונים של המוח מכרסם. משתמשים יכולים לבחון את התפקוד UPS בתוך שברים גרעיניים, cytoplasmic וסינפטית באותו בעל חיים, הפחתת כמות הזמן ומספר בעלי החיים הדרושים כדי לבצע ניתוחים אלה מורכבים.
Abstract
מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין היא מווסת מפתח של השפלה חלבון ומגוון של תהליכים סלולריים אחרים eukaryotes. במוח, מגביר את הפעילות אוביקוויב-פרוטאספראט הם קריטיים לפלסטיות הסינפטית והיווצרות הזיכרון והשינויים החריגה במערכת זו משויכים למגוון של הפרעות נוירולוגיות, ניווניות ופסיכיאטריות. אחד הנושאים ללמוד אוביקוויב-פרוטאסאט התפקוד במוח הוא שהוא קיים בכל התאים הסלולריים, שבו מטרות החלבון, התפקיד הפונקציונלי ומנגנונים של רגולציה יכול להשתנות באופן נרחב. כתוצאה מכך, היכולת להשוות במישרין את המוח אוביקוויב חלבון מיקוד ופעילות מיקרוביאלית בתאי משנה שונים בתוך אותה חיה היא קריטית להבנה מלאה כיצד UPS תורמת לפלסטיות הסינפטית, זיכרון ומחלות. השיטה המתוארת כאן מאפשרת איסוף של גרעיני, cytoplasmic ושברים סינפטית גולמיים מן מכרסם אותו (עכברוש) המוח, ואחריו כימות בו של פעילות מיקרוביאלית של הפרוטאסאט (בעקיפין, מתן פעילות של הליבה פרוטאסדום בלבד) ותיוג חלבונים אוביקוויב ספציפי לקישור. כך, ניתן להשתמש בשיטה כדי להשוות ישירות שינויים משניים בפעילות אוביקוויב-פרוטאסאין באזורי מוח שונים באותה חיה במהלך הפלסטיות הסינפטית, היווצרות הזיכרון ומצבי מחלה שונים. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך את ההתפלגות והתפקוד התת-תאית של חלבונים אחרים בתוך אותה חיה.
Introduction
מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין (UPS) היא רשת מורכבת של מבני חלבון מחוברים וליגסים השולטים בהשפלה של רוב החלבונים הקצרי-החיים בתאים1. במערכת זו, חלבונים מסומנים עבור השפלה או תהליכים סלולריים אחרים/גורלות על ידי משנה קטן אוביקוויב. חלבון היעד יכול לרכוש 1-7 אוביקוויב שינויים, אשר יכול לקשר יחד באחד 7 ליזין (K) אתרים (K6, K11, K27, K29, K33, K48 ו-K63) או מתיונין N-טרמינל (M1; הידוע בשם ליניארי) ב אוביקווילין הקודם2. חלק מתגי polyubiquitin אלה הם ספציפיים להשפלה (K48)3, בעוד אחרים הם עצמאיים במידה רבה של תהליך השפלה חלבון (M1)4,5,6. כך, תהליך החלבון אוביקווינציה מורכב מאוד ואת היכולת לכמת שינויים תג polyubiquitin מסוים הוא קריטי בסופו של דבר להבין את התפקיד של שינוי נתון בתפקוד הסלולר. עוד מסבך את המחקר של מערכת זו, פרוטאסדום, שהוא מבנה קטליטי של UPS7, שניהם מואפים חלבונים אבל יכול גם להיות מעורב בתהליכים אחרים שאינם נגד הפרוטחרדה8,9. לא באופן מפתיע אז, מאז התגלית הראשונית שלה, הפעילות הרגילה אוביקוויב-פרוטאסאין מעורבים היווצרות זיכרון ארוך טווח ומגוון של מצבי מחלה, כולל הרבה נוירולוגי, נוירוניווניות ופסיכיאטרי הפרעות10,11. כתוצאה מכך, שיטות שיכולות ביעילות וביעילות לכמת UPS פעילות במוח הם קריטיים להבנת בסופו של דבר כיצד מערכת זו אינה מוסדרת במצבי מחלה ופיתוח בסופו של דבר אפשרויות טיפול מיקוד אוביקוויב ו/או . התפקוד הפרוטאלי
ישנם מספר סוגיות בתחום הפעילות אוביקוויטים-פרוטאסאין ברקמת המוח מחולדות ועכברים, שהם מערכות המודל הנפוצות ביותר המשמשות לחקר הפונקציה UPS, כולל 1) המגוון של אוביקוויטים שינויים, ו 2) הפצה ו הוויסות הדיפרנציאלי של UPS מתפקד על פני תאים תת-סלולריים12,13,14. למשל, רבים של ההפגנות המוקדמות של הפונקציה אוביקוויב-פרוטאסאט במוח במהלך היווצרות הזיכרון השתמשו לוחות תא שלם והצביעו עליות הזמן התלויות הן אוביקוויציה חלבונים ופעילות פרוטסאין15, מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , 20. עם זאת, מצאנו לאחרונה כי פעילות אוביקוויב-פרוטאסאין מגוונת באופן נרחב על פני תאים subcellular בתגובה ללמידה, עם עליות בו באזורים מסוימים ופוחתת באחרים, דפוס שונה באופן משמעותי ממה שדווח בעבר בתא שלם21. זה תואם את המגבלה של גישה שלמה התא, כפי שהוא אינו יכול לנתק את התרומה של שינויים בפעילות ה-UPS על פני תאים משניים שונים. למרות מחקרים שנעשו לאחרונה השתמשו בפרוטוקולים השבר הסינפטית כדי לחקור את UPS במיוחד על הסינפסות בתגובה ללמידה22,23,24, השיטות בשימוש סגר את היכולת למדוד . שינויים באותה החיה התוצאה היא צורך מיותר לחזור על ניסויים מספר פעמים, איסוף שבר שונה הסלולר בכל אחד. לא רק תוצאה זו היא הפסד גדול יותר של חיי בעלי חיים, אבל זה מבטל את היכולת להשוות במישרין את פעילות ה-UPS על פני תאים תת תאיים שונים בתגובה לאירוע נתון או במהלך מצב מחלה מסוים. בהתחשב בכך מטרות החלבון של אוביקוויב ו-פרוטאסאט משתנים באופן נרחב ברחבי התא, הבנה כיצד אוביקוויב-פרוטאסאט איתות שונה בתאי subcellular נפרדים הוא קריטי לזיהוי התפקיד הפונקציונלי של ה-UPS ב מוח בזמן היווצרות הזיכרון והפרעות נוירולוגיות, ניווניות ופסיכיאטריות.
כדי לטפל בצורך זה, פיתחנו לאחרונה הליך שבו ניתן היה לאסוף שברים גרעיניים, cytoplasmic וסינפטית עבור אזור מוחי נתון מאותה חיה21. בנוסף, כדי להסביר את כמות החלבון המוגבלת שניתן להשיג מאיסוף שברים תת-תאיים מרובים מאותה דוגמית, אנו ממוטבים פרוטוקולים שהוקמו בעבר לצורך שיטת הפעולה של מחוץ לפעילות והצמדה בתאי חלבון שנאספו מרקמת מוח מכרסמים. באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים לאסוף ולהשוות ישירות שינויים תלויי למידה בפעילות פרוטאספראט, K48, K63, M1 והכולל חלבון polyubiquitination רמות בגרעין הציטופלסמה ו ב הסינפסות באמיגדלה לרוחב של חולדות. כאן, אנו מתארים בפירוט ההליך שלנו (איור 1), אשר יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה שלנו כיצד UPS מעורב ביצירת זיכרון ארוך טווח ומצבים מחלות שונות. עם זאת, יש לציין כי בפעילות החוץ בלתי מתורבת הנדונה בפרוטוקול שלנו, תוך שימוש נרחב, לא ישירות למדוד את הפעילות של השלם מתחמים 26 של המלא. ליתר דיוק, שיטת הפעולה הזו מודדת את הפעילות של הליבה של 20, כלומר היא יכולה לשמש רק כפרוקסי כדי להבין את הפעילות של הליבה עצמה בניגוד למכלול כולו 26 של מורכבות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו להדגים שיטה יעילה לכמת שינויים בפעילות אוביקוויב-פרוטאסאט באמצעות תאים שונים subcellular באותה חיה. כיום, רוב הנסיונות למדידת שינויי הסלולר בפעילות של מערכת אוביקוויב-פרוטאסביט הוגבלה לתא אחד לכל מדגם, והתוצאה היא צורך לחזור על ניסויים. זה מוביל לעלויות משמעותיות ולאובדן חיי בעלי חיי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי כספי הפעלה מהמכללה למדעי החקלאות והחיים והמכללה למדעים ב-וירג טק. ט נתמכת על ידי תוכנית ג’ורג ‘ וושינגטון קארבר ב וירג טק.
Materials
| 0.5M EDTA | Fisher | 15575020 | Various other vendors |
| 20S Proteasome Activity Kit | Millipore Sigma | APT280 | Other vendors carry different versions |
| ATP | Fisher | FERR1441 | Various other vendors |
| Beta-actin antibody | Cell signaling | 4967S | Various other vendors |
| Beta-tubulin antibody | Cell signaling | 2128T | Various other vendors |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | VATECHH1MT3 | Other vendors carry different versions |
| B-mercaptoethanol | Fisher | ICN19024280 | Various other vendors |
| clasto lactacystin b-lactone | Millipore Sigma | L7035 | Various other vendors |
| Cryogenic cup | Fisher | 033377B | Various other vendors |
| DMSO | DMSO | D8418 | Varous other vendors |
| DTT | Millipore Sigma | D0632 | Various other vendors |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | Various other vendors |
| H3 antibody | Abcam | ab1791 | Various other vendors |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Various other vendors |
| Hydrochloric acid | Fisher | SA48 | Various other vendors |
| IGEPAL (NP-40) | Millipore Sigma | I3021 | Various other vendors |
| K48 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab140601 | Various other vendors |
| K63 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab179434 | Various other vendors |
| KCl | Millipore Sigma | P9541 | Various other vendors |
| KONTES tissue grinder | VWR | KT885300-0002 | Various other vendors |
| Laemmli sample buffer | Bio-rad | 161-0737 | Various other vendors |
| Linear Ubiquitin Antibody | Life Sensors | AB-0130-0100 | Only M1 antibody |
| MgCl | Millipore Sigma | 442611 | Various other vendors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 2231000213 | Various other manufacturers/models |
| myr-AIP | Enzo Life Sciences | BML-P212-0500 | Carried by Millipore-Sigma |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Various other vendors |
| Odyssey Fc Imaging System | LiCor | 2800-02 | Other vendors carry different versions |
| Phosphatase Inhibitor | Millipore Sigma | 524625 | Various other vendors |
| Precision Plus Protein Standard | Bio-rad | 161-0373 | Various other vendors |
| Protease Inhibitor | Millipore Sigma | P8340 | Various other vendors |
| PSD95 antibody | Cell signaling | 3450T | Various other vendors |
| SDS | Millipore Sigma | L3771 | Various other vendors |
| Sodium hydroxide | Fisher | SS255 | Various other vendors |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | Various other vendors |
| TBS | Alfa Aesar | J62938 | Varous other vendors |
| Tris | Millipore Sigma | T1503 | Various other vendors |
| Tween-20 | Fisher | BP337-100 | Various other vendors |
| Ubiquitin Antibody | Enzo Life Sciences | BML-PW8810 | Various other vendors |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
- Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
- Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
- Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
- Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
- Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
- Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
- Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
- Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
- Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
- Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).
- Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
- Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
- Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
- Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
- Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
- Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
- Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
- Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
- Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
- Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
- Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).
