Kwantificerende Subcellulaire Ubiquitin-proteasome activiteit in het knaagdier hersenen

Het ubiquitin-proteasome systeem (UPS) is een complex netwerk van onderling verbonden eiwit structuren en ligasen die de afbraak van de meeste kortstondige eiwitten in de cellen¹regelt. In dit systeem, eiwitten zijn gemarkeerd voor afbraak of andere cellulaire processen/Fates door de kleine modifier ubiquitin. Een doeleiwit kan 1-7 ubiquitine-modificaties verwerven, die samen kunnen linken op een van de zeven lysine (K)-sites (K6, K11, K27, K29, K33, K48 en K63) of de N-terminale methionine (M1; zoals lineair genoemd) in de vorige ubiquitine². Sommige van deze polyubiquitin Tags zijn afbraak-specifieke (K48)³, terwijl anderen zijn grotendeels onafhankelijk van het eiwitafbraak proces (M1)^4,5,6. Zo is het eiwit Ubiquitination proces ongelooflijk complex en het vermogen om veranderingen in een specifieke polyubiquitin-tag te kwantificeren is van cruciaal belang om uiteindelijk de rol van die gegeven modificatie in cellulaire werking te begrijpen. Door de studie van dit systeem verder te compliceren, is het proteasome, dat de katalytische structuur van de ups⁷is, beide eiwitten degradeert, maar kan het ook worden betrokken bij andere niet-Proteolytische processen^8,9. Niet verrassend dan, sinds de eerste ontdekking, normale en afwijkende ubiquitin-proteasome activiteit is betrokken bij de lange-termijn Geheugenvorming en een verscheidenheid van ziektetoestanden, met inbegrip van vele neurologische, neurodegeneratieve en psychiatrische aandoeningen^10,11. Als gevolg hiervan zijn methoden die effectief en efficiënt de activiteit van UPS in de hersenen kunnen kwantificeren essentieel om uiteindelijk te begrijpen hoe dit systeem wordt ontregeld in ziektetoestanden en de uiteindelijke ontwikkeling van behandelingsopties die gericht zijn op ubiquitine en/of proteasoom functioneren.

Er zijn een aantal problemen bij het kwantificeren van ubiquitine-proteasome activiteit in hersenweefsel van ratten en muizen, de meest voorkomende modelsystemen die worden gebruikt om de UPS-functie te bestuderen, waaronder 1) de diversiteit van ubiquitine-modificaties, en 2) distributie en differentiële regulering van ups die in subcellulaire compartimenten^12,13en¹⁴functioneren. Bijvoorbeeld, veel van de vroege demonstraties van ubiquitin-proteasoom functie in de hersenen tijdens Geheugenvorming gebruikt hele celllysates en aangegeven tijdafhankelijke verhogingen in beide eiwit Ubiquitination en proteasoom activiteit^{15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20}. we vonden echter onlangs dat ubiquitin-proteasome-activiteit sterk varieerde over subcellulaire compartimenten in reactie op leren, met gelijktijdige stijgingen in sommige regio’s en dalingen in andere, een patroon dat aanzienlijk verschilt van wat eerder werd gerapporteerd in de hele cel eiwitlysaten²¹. Dit is in overeenstemming met de beperking van een hele celbenadering, omdat het de bijdrage van veranderingen in de UPS-activiteit in verschillende subcellulaire compartimenten niet kan ontkoppelen. Hoewel meer recente studies hebben gebruikt synaptische fractie protocollen voor het bestuderen van de ups specifiek op synapsen in reactie op het leren van^22,23,24, de gebruikte methoden occlude de mogelijkheid om te meten nucleaire en cytoplasmische ubiquitine-proteasome veranderingen in hetzelfde dier. Dit resulteert in een onnodige noodzaak om experimenten meerdere malen herhalen, het verzamelen van een andere subcellulaire Fractie in elk. Dit resulteert niet alleen in een groter verlies van dier levens, maar elimineert de mogelijkheid om de UPS-activiteit direct te vergelijken met verschillende subcellulaire compartimenten in reactie op een bepaalde gebeurtenis of tijdens een specifieke ziektestatus. Gezien het feit dat eiwit doelen van ubiquitine en het proteasoom sterk variëren in de cel, begrijpen hoe ubiquitine-proteasoom signalering verschilt in verschillende subcellulaire compartimenten is essentieel voor het identificeren van de functionele rol van de ups in de hersenen tijdens Geheugenvorming en neurologische, neurodegeneratieve en psychiatrische stoornissen.

Om deze behoefte aan te pakken, hebben we onlangs een procedure ontwikkeld waarin nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties kunnen worden verzameld voor een bepaald hersengebied van hetzelfde dier²¹. Om rekening te houden met de beperkte hoeveelheid eiwitten die kan worden verkregen uit het verzamelen van meerdere subcellulaire fracties uit hetzelfde monster, hebben we eerder vastgestelde protocollen geoptimaliseerd om in vitro proteasoom activiteit en koppelings-specifieke eiwit ubiquitinatie in gelyseerd cellen verzameld uit knaagdier hersenweefsel. Met behulp van dit protocol, we waren in staat om te verzamelen en direct te vergelijken leer afhankelijke veranderingen in proteasoom activiteit, K48, K63, M1 en algehele eiwit polyubiquitination niveaus in de Nucleus en cytoplasma en bij synapsen in de laterale amygdala van ratten. Hier beschrijven we in detail onze procedure (Figuur 1), die ons begrip van hoe de ups betrokken is bij de lange termijn Geheugenvorming en verschillende ziektetoestanden aanzienlijk zou kunnen verbeteren. Echter, opgemerkt moet worden dat de in vitro proteasoom activiteit die in ons protocol wordt besproken, terwijl op grote schaal gebruikt, niet direct de activiteit van complete 26s proteasoom complexen meet. Eerder, deze bepaling meet de activiteit van de kern van de 20s, wat betekent dat het kan alleen dienen als een volmacht om te begrijpen van de activiteit van de kern zelf in tegenstelling tot de gehele 26s proteasoom complex.