قياس النشاط شبه الخلوي يوبيكويتين بروتياسوم في الدماغ القوارض

نظام ubiquitin-proteasome (UPS) هو شبكة معقدة من هياكل البروتين المترابطة والأربطة التي تتحكم في تدهور معظم البروتينات قصيرة الأجل في الخلايا¹. في هذا النظام، يتم وضع علامة على البروتينات للتحلل أو غيرها من العمليات الخلوية / مصائر من قبل فيوكويتين المعدل الصغيرة. يمكن للبروتين المستهدف الحصول على 1-7 تعديلات يوبيكويتين، والتي يمكن أن تربط معا في واحد من سبعة مواقع يسين (K) (K6، K11، K27، K29، K33، K48 و K63) أو ميثيونين N-الطرفية (M1؛ كما هو معروف باسم الخطي) في ubiquitin السابقة². بعض من هذه العلامات polyubiquitin هي تدهور محددة (K48)³, في حين أن البعض الآخر مستقلة إلى حد كبير عن عملية تدهور البروتين (M1)^4,5,6. وهكذا، فإن عملية انتشار البروتين معقدة بشكل لا يصدق والقدرة على قياس التغيرات في علامة بوليوبيكتين محددة أمر بالغ الأهمية لفهم دور ذلك التعديل في الأداء الخلوي في نهاية المطاف. زيادة تعقيد دراسة هذا النظام، وبروتياسوم، وهو الهيكل الحفاز للUPS⁷، على حد سواء يتحلل البروتينات ولكن يمكن أيضا أن تشارك في عمليات أخرى غير بروتيوليتيك^8،9. ليس من المستغرب بعد ذلك، منذ اكتشافه الأولي، وقد تورط النشاط العادي والشاذ في ubiquitin-proteasome في تكوين الذاكرة على المدى الطويل ومجموعة متنوعة من حالات المرض، بما في ذلك العديد من العصبية، العصبية والنفسية اضطرابات^10,11. ونتيجة لذلك، فإن الأساليب التي يمكن أن تحدد بشكل فعال وفعال نشاط UPS في الدماغ حاسمة لفهم في نهاية المطاف كيف يتم تنظيم هذا النظام في حالات المرض والتطوير النهائي لخيارات العلاج التي تستهدف في كل مكان و / أو أداء بروتياسوم.

هناك عدد من القضايا في قياس النشاط في كل مكان بروتيسوم في أنسجة الدماغ من الفئران والفئران، والتي هي النظم النموذجية الأكثر شيوعا المستخدمة لدراسة وظيفة يو بي سي، بما في ذلك 1) تنوع التعديلات ubiquitin، و 2) توزيع و التنظيم التفاضلي لUPS يعمل عبر المقصورات دون الخلوية^12،13،14. على سبيل المثال، العديد من المظاهرات المبكرة من وظيفة ubiquitin-بروتياسوم في الدماغ أثناء تكوين الذاكرة تستخدم lysates الخلية بأكملها وأشار إلى زيادات تعتمد على الوقت في كل من البروتين في كل مكان والنشاط بروتياسوم^{15، 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19 سنة , 20.}ومع ذلك، وجدنا مؤخرا أن النشاط ubiquitin-proteasome تختلف على نطاق واسع عبر المقصورات دون الخلوية استجابة للتعلم، مع زيادات متزامنة في بعض المناطق والانخفاض في مناطق أخرى، وهو نمط يختلف اختلافا كبيرا من ما تم الإبلاغ عنه سابقا في خلية كاملة lysates²¹. وهذا يتسق مع الحد من نهج الخلية بأكملها، كما أنه لا يمكن فصل مساهمة التغييرات في نشاط UPS عبر مقصورات دون الخلوية المختلفة. على الرغم من أن الدراسات الحديثة قد استخدمت بروتوكولات الكسور متشابك لدراسة UPS على وجه التحديد في نقاط الاشتباك العصبي استجابة للتعلم^22،23،24، والأساليب المستخدمة occlude القدرة على قياس النووية والسيتوبلازمية في كل مكان بروتياسوم التغيرات في نفس الحيوان. وهذا يؤدي إلى حاجة لا لزوم لها لتكرار التجارب عدة مرات، وجمع كسر دون الخلوية مختلفة في كل. وهذا لا يؤدي فقط إلى خسارة أكبر في الأرواح الحيوانية، ولكنه يلغي القدرة على مقارنة نشاط يو بي سي مباشرة عبر مقصورات دون خلوية مختلفة استجابة لحدث معين أو أثناء حالة مرض معين. وبالنظر إلى أن أهداف البروتين من ubiquitin وبروتياسوم تختلف على نطاق واسع في جميع أنحاء الخلية، وفهم كيف يختلف الإشارات ubiquitin-proteasome في مقصورات دون الخلوية متميزة أمر بالغ الأهمية لتحديد الدور الوظيفي للUPS في الدماغ أثناء تكوين الذاكرة والاضطرابات العصبية والعصبية والنفسية.

لتلبية هذه الحاجة، قمنا مؤخرا بتطوير إجراء حيث يمكن جمع الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابك لمنطقة الدماغ معينة من نفس الحيوان²¹. بالإضافة إلى ذلك، لحساب كمية محدودة من البروتين التي يمكن الحصول عليها من جمع كسور دون الخلوية متعددة من نفس العينة، ونحن الأمثل البروتوكولات المنشأة سابقا لفحص في المختبر نشاط بروتياسوم والربط محددة البروتين في كل مكان في الخلايا اللمعة التي تم جمعها من أنسجة الدماغ القوارض. باستخدام هذا البروتوكول، تمكنا من جمع ومقارنة مباشرة التغيرات تعتمد على التعلم في النشاط بروتياسوم، K48، K63، M1 ومستويات تعدد النقاط البروتينية الشاملة في النواة والسيتوبلازم وفي نقاط الاشتباك العصبي في اللوزة الجانبية للفئران. هنا، ونحن نصف بالتفصيل إجراءنا ( الشكل1)،والتي يمكن أن تحسن بشكل كبير فهمنا لكيفية مشاركة UPS في تشكيل الذاكرة على المدى الطويل ومختلف حالات المرض. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن النشاط البروتياسوم في المختبر التي نوقشت في بروتوكولنا، على الرغم من استخدامها على نطاق واسع، لا يقيس مباشرة نشاط المجمعات بروتياسوم 26S كاملة. بدلا من ذلك، يقيس هذا الفحص نشاط جوهر 20S، وهذا يعني أنه يمكن أن يكون فقط بمثابة وكيل لفهم نشاط الأساسية نفسها بدلا من مجمع 26S بروتياسوم بأكمله.