Här beskriver vi en indirekt ELISA sandwich immunocapture att bestämma immunogenic glykoprotein innehållet i rabies vacciner. Detta test använder en neutraliserande monoklonal antikropp (mAb-D1) som känner igen glykoproteintrimmers. Det är ett alternativ till in vivo NIH-testet att följa konsistensen av vaccinpotens under produktionen.
Den växande globala oron för djurens välbefinnande uppmuntrar tillverkare och nationella kontrolllaboratorier att följa 3R-strategin för ersättning, minskning och förfining av laboratoriedjursförsök. Utveckling av in vitro-metoder rekommenderas på WHO-nivå och europeisk nivå som alternativ till NIH-testet för utvärdering av rabiesvaccinpotensen. På ytan av rabiesvirus (RABV) partikel, trimers av glykoprotein utgör de viktigaste immunogen att inducera viral neutraliserande antikroppar (VNAbs). Ett ELISA-test, där neutraliserande monoklonala antikroppar (mAb-D1) känner igen den trimeriska formen av glykoproteinet, har utvecklats för att bestämma innehållet i det inbyggda vikta trimeric glykoproteinet tillsammans med produktionen av vaccinsatserna. Detta in vitro-potenstest visade en god överensstämmelse med NIH-testet och har befunnits lämpligt i samarbetsstudier av RABV vaccintillverkare och OMCLs. Undvikande av djuranvändning är ett uppnåeligt mål inom en snar framtid.
Den metod som presenteras är baserad på en indirekt ELISA sandwich immunocapture med hjälp av mAb-D1 som erkänner antigena platser III (aa 330 till 338) av trimeric RABV glykoprotein, dvs immunogenic RABV antigen. mAb-D1 används för både beläggning och detektion av glykoproteintrimmer som finns i vaccinpartiet. Eftersom epitopet är erkänt på grund av dess konformationsegenskaper, kan det potentiellt denaturerade glykoproteinet (mindre immunogent) inte fångas upp och detekteras av mAb-D1. Vaccinet som ska testas inkuberas i en plattsensibiliserad med mAb-D1. Bundna trimeric RABV glykoproteiner identifieras genom att lägga till mAb-D1 igen, märkt med peroxidas och sedan avslöjas i närvaro av substrat och chromogen. En jämförelse av den absorbans som uppmätts för det testade vaccinet och referensvaccinet gör det möjligt att fastställa den immunogena glykoproteinhalten.
Sedan mer än 50 år används NIH-testet1 som en guldstandardmetod för att utvärdera rabiesvaccinpotensen innan partiet släpps ut. Detta test består av en intraperitoneal immunisering av grupper av möss med det vaccin som ska testas följt av en intra-cerebral (IC) utmaning 14 dagar senare med Challenge Virus Standard (CVS) stam av rabiesvirus (RABV). Styrkan utvärderas från andelen möss som överlever IC-utmaningen. Även om WHO2 och European Pharmacopeia3 fortfarande kräver NIH-testet för att bedöma vaccinets styrka, lider detta test av flera hinder: resultaten är mycket varierande4; Infektiös RABV används under utmaningen och detta kräver både teknisk skicklighet och stränga åtgärder för biosäkerhet. ett stort antal djur används, och utmaningens allvar ger upphov till allvarliga etiska betänkligheter5. En mindre allvarlig variation av detta test har utvecklats: två veckor efter den intra peritoneala immuniseringen utmanas möss inte av IC utan avblodas och testas för förekomst av specifika RABV-neutraliserande antikroppar (VNAbs) i serumet med hjälp av ett in vitro-neutraliseringstest. Detta test kräver dock fortfarande att man offrar ett stort antal laboratoriemöss även om det redan används för veterinärmedicinskavaccinerna 6,,7 och har övervägts för humanvaccin8.
Från och med nu, både International9 och Europeiska10 rekommendationer uppmuntra tillverkare och nationella kontrolllaboratorier (officiella laboratorier för medicin kontroll – OMCLs) att genomföra ersättning, minskning och förfining av laboratoriedjur testning, kallad 3Rs strategi. Eu-direktiv 2010/63/EU (som varit i kraft sedan 2013/01/01) om djurskydd och djurskydd har också förstärkt de begränsningar för vaccintillverkare och laboratorier som deltar i kvalitetskontrollen av rabiesvacciner samt rabiesforskning11. Som ett resultat av detta har utvecklingen, valideringen och användningen av alternativa in vitro-metoder nu blivit en prioritet. Dessa är inte bara etiskt sunda men kan också minska partiets testkostnader och förkorta tiden för resultat till timmar istället för vecka3.
På ytan av RABV partikel, glykoprotein antar en trimeric form12,13,14,15,16. I rabies vaccin, denna inhemska trimeric form utgör de viktigaste immunogen inducera VNAbs17 medan monomeric, lösliga eller denaturerade glykoproteiner är dåligt immunogenic18,19. Således är bevarandet av trimers av glykoproteinet längs vaccinproduktionsprocessen en bra indikator för bevarandet av en optimal immunogen potential. Flera immunokemiska metoder, såsom antikroppsbindningstestet20,21, test22 av en radiell immundiffusion (SRD) och ELISA-testet23,,24,,25,26,27 rekommenderas av WHO:s tekniska rapport serie2 och den europeiska monografin3 för att kvantifiera antigenhalten i rabiesvacciner. Dessa används av tillverkarna för att övervaka konsekvensen i vaccinproduktionen och av OMCL för att bedöma den konsekventa formuleringen av partier avhumanvacciner 28, även om NIH-testet fortfarande övervägs för styrkan.
Emellertid, alla dessa immunokemiska metoder är inte likvärdiga. SRD-testet kräver en förbehandling som kan förändra de membranförankrade trimers och resultera i en löslig eller denaturerad form av glykoproteinet22,29. Därför är SRD inte mycket effektivt när det gäller att diskriminera mellan immunogena och icke-immunogena glykoproteiner som resulterar i en ofullständig bedömning av immunogeniciteten hos ett vaccinparti. Däremot är ELISA-testet känsligare22, bevarar glykoproteinets ursprungliga struktur och är lämpligare för att bestämma innehållet i de inbyggda vikta trimersna av glykoprotein. ELISA-testet kan använda antingen kaninpolyklonala eller mus monoklonala anti-glykoproteinantikroppar som renats eller koncentrerats med ammoniumsulfat. Studier har visat god överensstämmelse mellan NIH-testet och det antigeninnehåll som utvärderats av ELISA i vacciner och kommit fram till att ELISA-metoderna är lämpliga för in vitro-potenstestet. Detta förespråkar att ELISA-tester åtminstone kan komplettera eller till och med ersätta NIH-testet4,,26,,27,,30,,31,,32,33. I dag rekommenderar Europeiska farmakopén användning av validerade serologiska eller immunokemiska analyser som alternativ till NIH-testet3. Det fullständiga undvikandet av djuranvändning för vaccinpotens har blivit ett realistiskt perspektiv.
Den metod som presenteras nedan är baserad på en indirekt ELISA sandwich immunocapture med hjälp av en mus monoklonal antikropp klon (mAb-D1) som känner igen antigena platser III (aa 330 till 338) av trimeric RABV glykoprotein15,34. Denna metod utvecklades ursprungligen vid Institut Pasteur26,30 sedan optimeras och valideras av Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) laboratorium, dvs den franska OMCL4,33. MAb-D1 används både för att sensibilisera plattan och därefter för att upptäcka det fångade antigenet. Detta möjliggör specifik kvantifiering av glykoproteintrimmarna, dvs det immunogena RABV-antigenet. Den mAb-D1 som används för detektion är märkt med peroxidas, vilket avslöjas i närvaro av substratet och chromogen. En jämförelse av den absorbans som uppmätts för det testade vaccinet och referensvaccinet gör det möjligt att fastställa den immunogena glykoproteinhalten. Det är att notera att samma typ av analys kan tillämpas för olika mAbs erkänner olika antigena platser av RABV glykoprotein35. Metoden för att erhålla och rena eller koncentrera med ammoniumsulfat anti-glykoprotein polyklonanal kanin immunglobuliner G (IgG) eller monoklonala musglobuliner har beskrivits utförligt tidigare36 tillsammans med metoden att konjugate antikroppar med peroxidas37.
Epitopet som erkänns av mAb-D1 ligger i det antigena området III av RABV glykoprotein som inte bara är immun-dominerande för induktion av VNAbs men också deltar i neurovirulens, patogenicitet40,41 och receptorerkännande42. Det finns en annan viktig antigen plats längs glykoprotein, plats II43, mot vilken flera MAbs har isolerats såsom mAb-WI-111235. Dessa kan också användas i liknan…
The authors have nothing to disclose.
Dr Sylvie Morgeaux och Dr Jean-Michel Chapsal måste erkännas för deras viktigaste deltagande för att upprätta ELISA analys på vaccin partier och att organisera internationella workshops och samarbetsstudier. Vi tackar Sabrina Kali för kritisk läsning av manuskriptet. Dr Pierre Perrin var ansvarig för isolering och karakterisering av mAb-D1. Detta arbete har huvudsakligen fått stöd av Institut Pasteur-finansieringen.
Class II Biological Safety Cabinet | ThermoFisher Scientific | 10445753 | if titrating live virus |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | good for binding to the loaded antibody |
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood | ThermoFisher Scientific | 12576606 | for the preparation of sulfuric acid |
Immunology Plate Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96 |
Dutscher | 55303 | good for binding to the loaded antibody |
Microplate Sealing Tape(100 sheets) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Microplate single mode reader Sunrise | TECAN | ||
Microplate shaker-incubator | Dutscher | 441504 | |
Microplate washer Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) | ThermoFisher Scientific | 4700880 |