In Vitro ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen

Seit mehr als 50 Jahren wird der NIH-Test¹ als Goldstandard-Methode zur Bewertung der Tollwut-Impfstoff-Potenz vor der Chargenfreigabe verwendet. Dieser Test besteht aus einer intraperitonealen Immunisierung von Mäusegruppen mit dem zu testenden Impfstoff, gefolgt von einer intrazerebralen (IC) Herausforderung 14 Tage später mit dem Challenge Virus Standard (CVS) Stamm des Tollwutvirus (RABV). Die Wirksamkeit wird anhand des Anteils der Mäuse bewertet, die die IC-Herausforderung überleben. Obwohl WHO² und European Pharmacopeia³ noch den NIH-Test zur Beurteilung der Impfstoffwirksamkeit benötigen, weist dieser Test mehrere Hürden auf: Die Ergebnisse sind hochvariabel⁴; infektiöse RABV wird während der Herausforderung verwendet, und dies erfordert sowohl technisches Geschick als auch strenge Biosicherheitsmaßnahmen; Eine große Anzahl von Tieren wird verwendet, und die Schwere der Herausforderung wirft ernste ethische Bedenken^{auf 5}. Eine weniger starke Variation dieses Tests wurde entwickelt: Zwei Wochen nach der intraperitonealen Immunisierung werden Mäuse nicht durch IC herausgefordert, sondern verbluten und auf das Vorhandensein spezifischer RABV-Neutralisationsantikörper (VNAbs) in ihrem Serum mit einem In-vitro-Neutralisationstest getestet. Dieser Test erfordert jedoch immer noch das Opfern einer großen Anzahl von Labormäusen, obwohl er bereits für die Veterinärimpfstoffe^6,7 verwendet wird und für die Humanimpfstoffe⁸in Betracht gezogenwurde.

Ab sofort ermutigen sowohl international^{9 als} auch European¹⁰ Empfehlungen Hersteller und National Control Laboratories (Official Medicine Control Laboratories – OMCLs), die Ersatz-, Reduktions- und Verfeinerung von Labortierversuchen, die als 3R-Strategie bezeichnet wird, umzusetzen. Die Europäische Richtlinie 2010/63/EU (in Kraft seit 2013/01/01) in Bezug auf den Schutz und das Wohlergehen von Tieren hat auch die Beschränkungen für Impfstoffhersteller und Laboratorien verschärft, die an der Qualitätskontrolle von Tollwutimpfstoffen sowie an der Tollwutforschung beteiligt sind¹¹. Infolgedessen haben die Entwicklung, Validierung und Nutzung alternativer In-vitro-Ansätze inzwischen Priorität. Diese sind nicht nur ethisch einwandfrei, sondern können auch die Kosten für Batch-Teste senken und die Zeit für die Ergebnisse auf Stunden statt Wochen³verkürzen.

An der Oberfläche des RABV-Teilchens nimmt das Glykoprotein eine trimerische Form^{an 12,,13,,14,,15,,16}. Im Tollwut-Impfstoff stellt diese native trimerische Form das hauptwichtigste Immunogen dar, das VNAbs¹⁷ induzieren, während die monomeren, löslichen oder denaturierten Glykoproteine schlecht immunogen sind^18,19. Somit ist die Erhaltung der Trimmer des Glykoproteins entlang des Impfstoffherstellungsprozesses ein guter Indikator für die Erhaltung eines optimalen immunogenen Potenzials. Mehrere immunchemische Methoden, wie der Antikörper-Bindungstest^20,21, der Single Radial Immunodiffusion (SRD) Test²² und der ELISA-Test^{23,24,25,26,27} werden vom TECHNISCHEN Bericht der WHO² und der europäischen Monographie³ zur Quantifizierung des Antigengehalts in Tollwutimpfstoffen empfohlen. Diese werden von Herstellern zur Überwachung der Konsistenz der Impfstoffproduktion und von der OMCL verwendet, um die konsistente Formulierung von Chargen von Humanimpfstoffen zu bewerten²⁸, auch wenn der NIH-Test noch für die Wirksamkeit in Betracht gezogen wird.

Allerdings sind alle diese immunchemischen Methoden nicht gleichwertig. Der SRD-Test erfordert eine Vorbehandlung, die die membranverankerten Trimmer verändern und zu einer löslichen oder denaturierten Form des Glykoproteins^22,29führen kann. Daher ist SRD nicht sehr effizient bei der Unterscheidung zwischen immunogenen und nicht-immunogenen Glykoproteinen, was zu einer unvollkommenen Beurteilung der Immunogenität einer Impfstoffpartie führt. Im Gegensatz dazu ist der ELISA-Test empfindlicher²², bewahrt die native Struktur des Glykoproteins und ist besser geeignet, den Gehalt der nativ gefalteten Trimer von Glykoprotein zu bestimmen. Der ELISA-Test kann entweder monoklonale oder Mausmonoklonale Antiglykoprotein-Antikörper verwenden, die gereinigt oder mit Ammoniumsulfat konzentriert sind. Studien haben eine gute Übereinstimmung zwischen dem NIH-Test und dem von ELISA in Impfstoffen bewerteten Antigengehalt gezeigt und sind zu dem Schluss gekommen, dass ELISA-Methoden für den In-vitro-Potenztest geeignet sind. Dies spricht dafür, dass ELISA-Tests den NIH-Test mindestens ergänzen oder sogar ersetzen können^{4,26,27,30,31,32,33}. Heute empfiehlt das Europäische Arzneibuch die Verwendung validierter serologischer oder immunchemischer Assays als Alternativen zum NIH-Test³. Die vollständige Vermeidung der Verwendung von Tieren für die Impfstoffwirksamkeit ist zu einer realistischen Perspektive geworden.

Die nachfolgend vorgestellte Methode basiert auf einer indirekten ELISA-Sandwich-Immunaufnahme mit einem mausmonoklonalen Antikörperklon (mAb-D1), der die antigenen Stellen III (aa 330 bis 338) des trimeren RABV-Glykoproteins^15,34erkennt. Diese Methode wurde zunächst im Institut Pasteur^26,30 entwickelt und dann vom Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) Labor, d.h. dem französischen OMCL^4,33, optimiert und validiert. Der mAb-D1 wird sowohl zur Sensibilisierung der Platte als auch anschließend zur Erkennung des erfassten Antigens eingesetzt. Dies ermöglicht die spezifische Quantifizierung der Glykoproteintrimer, d.h. des immunogenen RABV-Antigens. Das für den Nachweis verwendete mAb-D1 ist mit Peroxidase gekennzeichnet, die sich in Gegenwart des Substrats und Chromogens zeigt. Der Vergleich der für den getesteten Impfstoff gemessenen Absorption und des Referenzimpfstoffs ermöglicht die Bestimmung des immunogenen Glykoproteingehalts. Es ist erwähnenswert, dass die gleiche Art von Assay für verschiedene mAbs angewendet werden kann, die verschiedene antigene Stellen des RABV Glykoproteins³⁵erkennen. Die Methode zur Gewinnung und Reinigung oder Konzentrat mit Ammoniumsulfat Anti-Glykoprotein Polyklonal Kaninchen Immunglobuline G (IgG) oder monoklonale Mausglobuline wurden ausführlich beschrieben zuvor³⁶ zusammen mit dem Verfahren zur Konjugatierung von Antikörpern mit Peroxidase³⁷.