狂犬病ワクチンの効力を評価するインビトロELISA試験

50年以上にわたり、NIH試験¹は、バッチ放出前に狂犬病ワクチンの効力を評価するための金標準法として使用される。この検査は、ワクチンを用いたマウス群の腹腔内免疫を含み、その後14日後に狂犬病ウイルス(CVS)株のチャレンジウイルスウイルス(RABV)で脳内(IC)チャレンジが行われる。効力は、ICチャレンジを生き残ったマウスの割合から評価されます。WHO²および欧州薬局方³はワクチンの効力を評価するためにNIH試験を必要としますが、このテストはいくつかのハードルに苦しんでいます:結果は非常に可変^的です。感染性RABVは挑戦の間に使用され、これは技術的なスキルと厳格なバイオセーフティ対策の両方を必要とします。多数の動物が使用され、挑戦の重大度は深刻な倫理的懸念^{を提起する5}.この検査のあまり深刻なバリエーションが開発されました:腹膜内免疫の2週間後、マウスはICによって挑戦されるのではなく、リンビトロ中和試験を使用して血清中の特定のRABV中和抗体(VNAbs)の存在について血を流し、テストされます。しかし、この試験では、既に獣医ワクチン^6,7に使用されており、ヒトワクチン⁸に対して検討されているが^、7多くの実験用マウスを犠牲にする必要がある。

現在、インターナショナル⁹とヨーロッパ^{の両方の勧告}は、3R戦略と呼ばれる実験室動物実験の交換、削減、および改良を実施するためにメーカーと国立管理研究所(公式医学管理研究所 – OMCLs)を奨励しています。動物の保護と福祉に関連する欧州指令2010/63/EU(2013/01/01以降有効)は、狂犬病ワクチンの品質管理および狂犬病研究¹¹に関与するワクチンメーカーおよび研究所の制約も強化している。その結果、代替インビトロアプローチの開発、検証、使用が優先事項となっています。これらは倫理的に健全であるだけでなく、バッチテストのコストを削減し、結果の時間を週³ではなく数時間に短縮することもできます。

RABV粒子の表面において、糖タンパク質は、トリマリック形態^{12、13、14、15、1614,15を}採用^12,13する。狂犬病ワクチンにおいて、この天然三量体形態は^VNAbs17を誘導する主要な免疫原を構成し、一方、単量体、可溶性または変性糖タンパク質は免疫原性^18,19,19が不十分である。したがって、ワクチン産生過程に沿った糖タンパク質の三量体の保存は、最適な免疫原性ポテンシャルの保存のための良い指標である。³抗体結合検査^20、21、21単一ラジアル²⁰免疫拡散(SRD)試験22およびELISA試験²²²³23、24、25、26、27などのいくつかの免疫化学的方法は、WHO技術報告シリーズ²および欧州モノグラフ3によって、狂犬病ワクチン中の抗原含有量を定量化することを推奨する。^,24,25,26,27これらは、ワクチン産生の一貫性を監視するために製造業者によって使用され、NIH試験がまだ効力について考慮されている場合でも、ヒトワクチン²⁸のバッチの一貫した製剤を評価するためにOMCLによって使用される。

しかしながら、これらの免疫化学的方法はすべて同等ではない。SRD試験では、膜固定三量体を改変し、可溶性または変性型の糖タンパク質^22,29,をもたらす前処理が必要^です。したがって、SRDは免疫原性と非免疫原性の糖タンパク質の判別においてあまり効率的ではなく、ワクチンロットの免疫原性の不完全な評価をもたらす。対照的に、ELISA試験は、より敏感な²²であり、糖タンパク質の天然構造を保存し、そして糖タンパク質の天然に折り畳まれた三量体の含有量を決定するためにより適切である。ELISA試験では、ウサギポリクローナルまたはマウスモノクローナル抗糖タンパク質抗体を精製または硫酸アンモニウムで濃縮して使用できます。研究は、ワクチンでELISAによって評価されたNIH試験と抗原含有量との間の良好な一体性を実証し、ELISA法がインビトロ効力試験に適していると結論付けた。これは、ELISAテストが少なくとも^,NIHテスト^{,,,44、26、27、30、31、32、3326,}を補完するか、または置き換えるかもしれないと提唱しています。^2730313233今日、欧州薬局方は、NIH試験³の代替として検証された血清学的または免疫化学アッセイの使用を推奨しています。ワクチンの効力のための動物の使用の完全な回避は現実的な視点となっています。

以下に提示される方法は、トリメリックRABV糖タンパク質^15,34,34の抗原部位III(aa330〜338)を認識するマウスモノクローナル抗体クローン(mAb-D1)を用いた間接的ELISAサンドイッチ免疫キャプチャに基づいている。この方法は、最初にインスティトゥート・パスツール^26で開発されました,³⁰その後、アサート・ナショナル・ド・セクリテ・デュ・メディカメント・エ・デ・プロデュース・ド・サンテ(ANSM)研究所、すなわちフランスOMCL^4、3333によって最適化され、検証されました。⁴mAb-D1は、プレートを感作し、その後捕捉した抗原を検出するために使用される。これにより、糖タンパク質三量体、すなわち免疫原性RABV抗原の特異的定量が可能となる。検出に使用されるmAb-D1は、ペルオキシダーゼで標識され、これは基質およびクロモゲンの存在下で明らかにされる。試験ワクチンと基準ワクチンについて測定した吸光度の比較により、免疫原性糖タンパク質含有量の測定が可能になります。同じタイプのアッセイを、RABV糖タンパク質³⁵の異なる抗原部位を認識する異なるmAbsに適用できることに注意する。硫酸アンモニウムポリクローナルウサギ免疫グロブリンG(IgG)またはモノクローナルマウスグロブリンを得、精製または濃縮する方法は、ペルオキシダーゼ³⁷と共に抗体をコンジュゲートする方法とともに、これまでに³⁶を広範囲に説明してきた。