В Vitro ELISA тест для оценки бешенства вакцины потенции

С более чем 50 лет, тест NIH¹ используется в качестве золотого стандарта метод для оценки потенции вакцины против бешенства до выпуска партии. Этот тест состоит из интраперитонеальной иммунизации групп мышей с вакциной, которая должна быть протестирована с последующим внутримозговой (IC) вызов 14 дней спустя с Challenge Virus Standard (CVS) штамм вируса бешенства (RABV). Потенция оценивается по доле мышей, переживших вызов IC. Хотя ВОЗ² и Европейская Фармакопея³ по-прежнему требуют теста NIH для оценки потенции вакцины, этот тест страдает от нескольких препятствий: результаты весьма изменчивы⁴; инфекционные RABV используется во время вызова, и это требует как технические навыки и строгие меры биобезопасности; большое количество животных используются, и тяжесть проблемы вызывает серьезные этические проблемы⁵. Менее серьезные изменения этого теста была разработана: через две недели после внутриперитонеальной иммунизации, мышей не оспаривается IC, но кровь и испытания на наличие конкретных RABV нейтрализующих антител (VNAbs) в сыворотке крови с помощью теста на нейтрализацию in vitro. Тем не менее, этот тест по-прежнему требует жертвования большое количество лабораторных мышей, хотя он уже используется для ветеринарных вакцин^6,7 и был рассмотрен для человека^{вакцины 8}.

В настоящее время как международные^9, так и европейские¹⁰ рекомендаций поощряют производителей и национальные лаборатории контроля (Official Medicine Control Laboratories – OMCLs) к внедрению замены, сокращения и уточнения лабораторных испытаний на животных, именуемых стратегией 3Rs. Европейская директива 2010/63/EU (действует с 2013/01/01), касающаяся защиты и благополучия животных, также усилила ограничения для производителей вакцин и лабораторий, участвующих в контроле качества вакцин против бешенства, а также в исследованиях бешенства^11. В результате этого разработка, проверка и использование альтернативных подходов in vitro стали в настоящее время приоритетными. Это не только этически обоснованные, но и могут также сократить расходы на пакетное тестирование и сократить время для результатов до часов, а не недель³.

На поверхности частицы RABV гликопротеин принимает тримерическую форму^{12,,13,,14,,15,,16}. В вакцине против бешенства, эта родная форма тримерической представляет собой основной иммуноген индуцирования VNAbs¹⁷ в то время как мономерные, растворимые или денатурированные гликопротеины плохо иммуногенных^18,19. Таким образом, сохранение тримеров гликопротеина в процессе производства вакцины является хорошим показателем сохранения оптимального иммуногенного потенциала. Несколько иммунохимических методов, таких как антитела-связывающий-тест^20,21, один радиальный иммунодиффузии (SRD) тест²² и тест ELISA^23,24,25,26^,27 рекомендованы ВОЗ Технический доклад серии² и европейской монографии³ для количественной оценки содержания антигена в вакцинах против бешенства.²⁶ Они используются производителями для мониторинга согласованности производства вакцин и OMCL для оценки последовательной формулировки партий вакцин для человека²⁸, даже если тест NIH по-прежнему рассматривается для потенции.

Однако все эти иммунохимические методы не являются эквивалентными. Тест SRD требует предварительной обработки, которая может изменить мембранно-якорные тримеры и привести к растворимым или денатурированной форме гликопротеина^22,29. Таким образом, SRD не очень эффективно в дискриминации между иммуногенными и неиммуногенных гликопротеинов в результате несовершенной оценки иммуногенности вакцины много. В отличие от этого, тест ELISA является более чувствительным²², сохраняет родную структуру гликопротеина, и более подходит для определения содержания родной сложенные тримеры гликопротеина. Тест ELISA может использовать либо поликлональные поликлональные или мыши моноклональные антигликопротеиновые антитела очищены или концентрированы с сульфатом аммония. Исследования показали хорошее соответствие между тестом NIH и содержанием антигена, оцененным ELISA в вакцинах, и пришли к выводу, что методы ELISA подходят для теста на пробирку. Это выступает за то, что тесты ELISA могут по крайней мере дополнить или даже заменить тест NIH^{4,26,,27,30,31,32,33}. Сегодня Европейская Фармакопея рекомендует использовать проверенные серологические или иммунохимические анализы в качестве альтернативы тесту NIH³. Полное избегание использования животных для вакцины потенции стала реалистичной точки зрения.

Метод, представленный ниже, основан на косвенном иммунозахвате сэндвича ELISA с помощью клона моноклонального антитела мыши (mAb-D1), который распознает антигенные участки III (aa 330 до 338) тримерного гликопротеина RABV^15,34. Этот метод был разработан первоначально в Институте^{Пастера 26,30} затем оптимизированы и проверены ВАГении Посев де Медурат дю Медудемент и де produits де Санте (ANSM) лаборатории, т.е. французский OMCL^4,33. mAb-D1 используется как для сенсибилизации пластины, так и для обнаружения захваченного антигена. Это позволяет проводить конкретную количественную оценку тримеров гликопротеинов, т.е. иммуногенного антигена RABV. mAb-D1, используемый для обнаружения, маркируется пероксидазой, которая раскрывается в присутствии субстрата и хромогена. Сравнение абсорбции, измеренной для испытанной вакцины и эталонной вакцины, позволяет определить содержание иммуногенного гликопротеина. Следует отметить, что один и тот же тип анализ может быть применен для различных mAbs признавая различные антигенные участки ГЛИкопротеина RABV³⁵. Метод получения и очистки или концентрации с аммонием сульфат анти-гликопротеин поликлональных кролика иммуноглобулины G (IgG) или моноклональные мышки глобулины были широко описаны ранее³⁶ вместе с методом сопряжения антител с пероксидазы³⁷.