Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia

Desde hace más de 50 años, la prueba¹ de NIH se utiliza como método estándar de oro para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia antes de la liberación por lotes. Esta prueba consiste en una inmunización intraperitoneal de grupos de ratones con la vacuna que se va a probar seguida de un desafío intracerebral (IC) 14 días después con la cepa del virus Challenge (CVS) del virus de la rabia (RABV). La potencia se evalúa a partir de la proporción de ratones que sobreviven al desafío IC. Aunque la OMS² y la Farmacopea Europea³ todavía requieren la prueba de NIH para evaluar la potencia de la vacuna, esta prueba sufre varios obstáculos: los resultados son muy variables^4; RABV infeccioso se utiliza durante el desafío y esto requiere tanto la habilidad técnica como estrictas medidas de bioseguridad; se utilizan un gran número de animales, y la gravedad del desafío plantea serias preocupaciones éticas⁵. Se ha desarrollado una variación menos grave de esta prueba: dos semanas después de la inmunización intraperitoneal, los ratones no son desafiados por IC, sino que se desangran y se analizan para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes RABV específicos (VNAbs) en su suero mediante una prueba de neutralización in vitro. Sin embargo, esta prueba todavía requiere sacrificar un gran número de ratones de laboratorio, aunque ya está en uso para las vacunas veterinarias^6,7 y se ha considerado para vacunas humanas⁸.

A partir de ahora, tanto las recomendaciones^{Internacionales 9} como las¹⁰ Europeas alientan a los fabricantes y a los Laboratorios Nacionales de Control (Laboratorios Oficiales de Control de Medicina – Omcl) a implementar la estrategia de reemplazo, reducción y refinamiento de pruebas en animales de laboratorio, denominada estrategia 3R. La Directiva Europea 2010/63/UE (en vigor desde 2013/01/01) relativa a la protección y el bienestar de los animales también ha reforzado las limitaciones para los fabricantes de vacunas y los laboratorios que participan en el control de calidad de las vacunas contra la rabia, así como en la investigación de la rabia¹¹. Como resultado, el desarrollo, la validación y el uso de enfoques in vitro alternativos se han convertido en una prioridad. Estos no sólo son éticamente sólidos, sino que también pueden reducir los costos de pruebas por lotes y acortar el tiempo para los resultados a horas en lugar de semanas³.

En la superficie de la partícula RABV, la glicoproteína adopta una forma trimrica^{12,13,14,15,16}. En la vacuna antirrábica, esta forma trimérica nativa constituye el principal vNAbs inductor de inmunogenes^17, mientras que las glicoproteínas monoméricas, solubles o desnaturalizadas son poco inmunogénicas^18,19. Por lo tanto, la preservación de los recortadores de la glicoproteína a lo largo del proceso de producción de la vacuna es un buen indicador para la preservación de un potencial inmunogénico óptimo. Varios métodos inmunoquímicos, como la prueba de unión de anticuerpos^20,21, la prueba²² de inmunodifusión radial única y la prueba ELISA^{23,24,25,26,27} son recomendados por la serie² de informes técnicos de la OMS y la monografía europea³ para cuantificar el contenido de antígeno según las vacunas contra la rabia. Estos son utilizados por los fabricantes para monitorear la consistencia de la producción de vacunas y por la OMCL para evaluar la formulación consistente de lotes de vacunas humanas^28,, incluso si la prueba de NIH todavía se considera para la potencia.

Sin embargo, todos estos métodos inmunoquímicos no son equivalentes. La prueba DeSC requiere un pretratamiento que pueda alterar los trimers anclados por membrana y dar lugar a una forma soluble o desnaturalizada de la glicoproteína^22,,29. Por lo tanto, la SRD no es muy eficiente para discriminar entre glicoproteínas inmunogénicas y no inmunogénicas, lo que resulta en una evaluación imperfecta de la inmunogenicidad de un lote de vacunas. Por el contrario, la prueba ELISA es más sensible²², conserva la estructura nativa de la glicoproteína, y es más apropiada para determinar el contenido de los trimers plegados de forma nativa de glicoproteína. La prueba ELISA puede utilizar anticuerpos antiglicoproteínamono monoclonales de conejo o monoclonales de ratón purificados o concentrados con sulfato de amonio. Los estudios han demostrado una buena concordancia entre la prueba de NIH y el contenido de antígeno evaluado por ELISA en vacunas y han concluido que los métodos ELISA son adecuados para la prueba de potencia in vitro. Esto aboga por que las pruebas ELISA puedan al menos complementar o incluso reemplazar la prueba^4,26,^{27,30,31,32,33}.^, Hoy en día, la Farmacopea Europea recomienda el uso de ensayos serológicos o inmunoquímicos validados como alternativas a la prueba³de los NIH. La evasión completa del uso animal para la potencia de la vacuna se ha convertido en una perspectiva realista.

El método que se presenta a continuación se basa en una inmunocaptura de sándwich ELISA indirecta utilizando un clon de anticuerpos monoclonales de ratón (mAb-D1) que reconoce los sitios antigénicos III (aa 330 a 338) de la glicoproteína rabórica^15,,34. Este método fue desarrollado inicialmente en el Institut Pasteur^26,30 luego optimizado y validado por el laboratorio Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), es decir, el laboratorio francés OMCL^4,,33. El mAb-D1 se utiliza tanto para sensibilizar la placa como para detectar posteriormente el antígeno capturado. Esto permite la cuantificación específica de los recortadores de glicoproteína, es decir, el antígeno RABV inmunogénico. El mAb-D1 utilizado para la detección está etiquetado con peroxidasa, que se revela en presencia del sustrato y el cromógeno. La comparación de la absorbancia medida para la vacuna probada y la vacuna de referencia permite la determinación del contenido de glicoproteína inmunogénica. Es de destacar que el mismo tipo de ensayo se puede aplicar para diferentes mAbs que reconocen diferentes sitios antigénicos de la glicoproteína RABV³⁵. El método para obtener y purificar o concentrarse con globulinas policlonales de conejo policlonal de sulfato de amonio G (IgG) o monoclonales han sido ampliamente descritos anteriormente³⁶ junto con el método para conjugar anticuerpos con peroxidasa^37..