Hier stellen wir ein Protokoll zur vollautomatischen Radiobeschriftung von [11C]SNAP-7941 und zur Analyse der Echtzeitkinetik dieses PET-Tracers auf P-gp-extierende und nicht-extierende Zellen dar.
Die Positronenemissionstomographie (PET) ist eine wesentliche molekulare Bildgebungstechnik, die Einblicke in Wege und die Verwendung gezielter Radioligande für In-vivo-Untersuchungen bietet. Innerhalb dieses Protokolls wird eine robuste und zuverlässige ferngesteuerte Radiosynthese von [11C]SNAP-7941, einem Antagonisten des Melanin-konzentrierenden Hormonrezeptors 1, beschrieben. Die Radiosynthese beginnt mit cyclotron produziertem[11C]CO2, das anschließend durch einen Gasphasenübergang zu [11C]CH3OTf weiter umgesetzt wird. Dann wird dieses reaktive Zwischenprodukt in die Vorläuferlösung eingeführt und bildet den jeweiligen Radiotracer. Die chemische sowie die radiochemische Reinheit werden mittels RP-HPLC bestimmt, die routinemäßig im radiopharmazeutischen Qualitätskontrollprozess eingesetzt werden. Zusätzlich wird die Molaktivität berechnet, da sie eine Notwendigkeit für die folgenden kinetinen Echtzeituntersuchungen ist. Darüber hinaus wird [11C]SNAP-7941 auf MDCKII-WT- und MDCKII-hMDR1-Zellen angewendet, um die Auswirkungen der P-Glykoprotein-Expression (P-gp) auf die Zellakkumulation zu bewerten. Aus diesem Grund wird die P-gp-extierende Zelllinie (MDCKII-hMDR1) entweder ohne oder mit Blockierung vor Experimenten mittels des P-gp-Substrats ()-verapamil verwendet und die Ergebnisse werden mit denen verglichen, die für die Wildtypzellen beobachtet wurden. Der gesamte experimentelle Ansatz zeigt, wie wichtig ein präzises Zeitmanagement ist, das für jede präklinische und klinische Studie mit PET-Tracern, die mit kurzlebigen Nukliden wie Kohlenstoff-11 (Halbwertszeit: 20 min) radioaktiv gekennzeichnet sind, unerlässlich ist.
[11C] SNAP-7941 wurde als erster Positronen-Emissionstomographie (PET)-Tracer entwickelt, der auf den Melanin-konzentrierenden Hormonrezeptor 1 (MCHR1) abzielt – ein Rezeptor, der hauptsächlich an der zentralen Regulierung von Appetit und Nahrungsaufnahme beteiligt ist1. Die Carbon-11-Kennzeichnung von SNAP-7941, einem gut charakterisierten MCHR1-Antagonisten, ergab den authentischen PET-Tracer2,3,4,5. Die vollautomatische Radiosynthese ist jedoch eine große Herausforderung in Bezug auf die Zeitliche Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit mit dem kurzlebigen Radionuklid Carbon-11, das eine Halbwertszeit von 20 min6bietet. Die Gesamtsynthesezeit sollte auf ein Minimum beschränkt werden, und als Faustregel sollte 2-3 Halbwertszeiten (d.h. etwa 40-60 min für Kohlenstoff-11)7nicht überschreiten. Insbesondere müssen Syntheseverfahren für Radiotracer, die auf Rezeptorsysteme mit geringer Expressionsdichte abzielen, umfassend optimiert werden, um ausreichende Erträge und damit eine hohe Molaktivität zu erhalten8. Die synthetische Strategie folgt oft der Radionuklidproduktion innerhalb eines Zyklotrons und der Freisetzung von [11C]CO2 an den Synthesizer. Dort wird [11C]CO2 zunächst auf [11C]CH4 reduziert und anschließend mit Jod auf die Ausbeute reagiert [ 11C]CH3I über die Gasphasenmethode9,10. Weitere Behandlung mit Silbertriflate ergibt [11C]CH3OTf direkt online. Anschließend wird dieses reaktive Kohlenstoff-11-markierte Zwischenprodukt in eine Lösung eingeführt, die das Vorläufermolekül enthält. Eine automatisierte Radiosynthese beinhaltet zusätzlich einen Reinigungsprozess mit semipräparativem RP-HPLC inklusive nachträglicher Formulierung des Produktes, das für präklinische und klinische Studien geeignet ist.
Unabhängig von der Halbwertszeit des Radionuklids und dem Zeitaufwand der Radiosynthese ist die Pharmakokinetik eines Radiopharmazeutikums der kritischste Teil, der während der PET-Tracer-Entwicklung bewertet werden muss. In Bezug auf Neuroimaging ist der Hirneintrag des PET-Tracers die wichtigste Voraussetzung. Die Blut-Hirn-Schranke (BBB), eine “Sicherheitsgrenze” des Gehirns, drückt jedoch Efflux-Transporter hoch aus, die kleine Moleküle (z. B. PET-Tracer) entladen und deren Anwendbarkeit effizient behindern können.
Ein großer Nachteil bei der präklinischen Auswertung sind unerwartete Wechselwirkungen zu diesen Efflux-Transportern, die in In-vitro-Experimenten oft nicht erkannt werden und zum Versagen des PET-Tracers in vivo führen, wie bei [11C]SNAP-7941 beobachtet. Die PET-Bildgebung bei Ratten zeigte eine geringe Hirnansammlung, die nach Verabreichung des P-gp-Inhibitors Tariquidar11dramatisch zunahm. Diese Daten legten nahe, dass [11C]SNAP-7941 ein Substrat dieses Efflux-Transportersystems ist, das Dieligandbindung an zentrale MCHR1 behindert. Leider fehlt es immer noch an geeigneten In-vitro-Modellen, die die Vorhersage der BBB-Penetration in einem frühen Stadium der Tracer-Entwicklung ermöglichen.
Hier beschreiben wir die automatisierte Synthese von [11C]SNAP-7941 mit einem Synthesizer für Kohlenstoff-11-Methylierungen. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt darin, einen Überblick darüber zu geben, wie ein konsekutierter experimenteller Ansatz organisiert werden kann, einschließlich der automatisierten Synthese, Qualitätskontrolle sowie der aufeinanderfolgenden In-vitro-Evaluierung mit dem sehr kurzlebigen Nuklid kohlenstoff-11.
Zunächst werden die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Radiosynthese mit minimalem Zeitaufwand und maximalem Ertrag beschrieben. Dann wird ein zuverlässiges Qualitätskontrollverfahren eingerichtet, das den Radiotracer für potenzielle klinische Studien zur Verfügung stellt und die Kriterien des Europäischen Arzneibuchs12erfüllt. Die Quantifizierung der Molkonzentration und die Berechnung der jeweiligen Molaktivität ist eine wesentliche Voraussetzung für die aufeinanderfolgenden kinetischen Messungen.
Schließlich wird eine neue und einfache In-vitro-Methode zur Bewertung der Wechselwirkungen von [11C]SNAP-7941 zum Efflux-Transporter P-gp (hMDR1) vorgestellt. Das vorgeschlagene kinetische Modell verwendet ein einfach zu handhabendes Gerät, das eine sofortige Dateninterpretation ermöglicht und minimalen Zellkulturaufwand erfordert13.
Die Radiosynthese von [11C]SNAP-7941 wurde auf einem kommerziellen Synthesemodul etabliert. Durch die Möglichkeit, das Aufbereitungsverfahren vollständig zu automatisieren, wurde die Als zuverlässig erwiesene Radiosynthese nachgewiesen und Verbesserungen beim Strahlenschutz des Bedieners erzielt. Die Herstellung des Synthesizers hat einen enormen Einfluss auf die Qualität des Radiotracers, insbesondere in Bezug auf die Molaktivität. Daher ist es wichtig, ständig unter inerten Bedingungen (z. B. Heliumatmosphäre) zu arbeiten und alle Leitungen vor dem Reaktionsgefäß zu spülen (Ziellinie, [11C]CH3I Produktionszyklus und Reaktor (siehe Abbildung 2)). Darüber hinaus erhöht das Erhitzen der jeweiligen Fallen und Öfen vor Beginn der Synthese, um Feuchtigkeit und atmosphärischen Kohlenstoff zu entfernen, die Molaktivität vorteilhaft. Insbesondere die agOTf-Säule, mit graphitisiertem Kohlenstoff imprägniert, ist extrem feuchtigkeitsempfindlich. Schon geringe Mengen einer beliebigen Feuchtigkeitsquelle stören die Umwandlung von [11C]CH3I in [11C]CH3OTf. Vor Beginn der Synthese müssen die [11C]CO 2-Falle und die [11C]CH3I-Falle wieder auf Raumtemperatur abgekühlt werden, um ein nachfolgendes Fangen zu ermöglichen. Darüber hinaus wird empfohlen, den Vorläufer kurz vor Beginn der Synthese aufzulösen und die Basis direkt in die Vorläuferlösung einzutragen.
Die Qualitätskontrolle für Carbon-11-Radiotracer muss rationell auf einen kontinuierlichen und schnellen Arbeitsablauf ausgelegt sein. Die wichtigsten Parameter für Zellkulturstudien sind jedoch radiochemische Reinheit und molaren Aktivität, um gültige Ergebnisse zu erhalten. Eine korrekte Bewertung der Molaktivität erfordert eine robuste analytische HPLC-Methode und die Kalibrierkurve muss den Konzentrationsbereich des Endprodukts abdecken. Der schwierige Teil für Radiotracer besteht darin, eine Konzentration oberhalb der Quantifizierungsgrenze (LOQ) aufgrund kleiner Mengen zu erreichen, die während der Radiosynthese erzeugt werden. Daher besteht die Kunst darin, das Gleichgewicht zwischen hohen molaren Aktivitäten zu finden, um Rezeptorsättigung und hohe Konzentrationen zu vermeiden, um das nicht-radioaktive Signal noch quantifizieren zu können.
[11C] SNAP-7941 wurde als potentes Substrat des menschlichen P-gp-Transporters bestätigt, da in den unbehandelten oder fahrzeugbehandelten MDCKII-hMDR1-Zellen aufgrund des schnellen Ausflusses keine Ansammlung beobachtet wurde. Im Gegensatz dazu lieferten beide Versuchs-Setups (MDCKII-WT- oder vorblockierte MDCKII-hMDR1-Zellen) ähnliche Ergebnisse (Akkumulation von [11C]SNAP-7941), was die Vielseitigkeit dieses In-vitro-Assays unterstützt. MDCKII-hMDR1-Zellen eignen sich aufgrund ihrer stabilen Transfektion, ihres schnellen Wachstums und der anhaltenden Scherbelastung durch die rotierende Zellkulturschale hervorragend für LigandTracer-Experimente. Das Fehlen von [11C]SNAP-7941 Aufnahme im Ratten- und Mäusehirn kann daher durch Efflux durch den P-gp Transporter verursacht werden. Aufgrund der Transfektion von Canine-Nierenzellen mit dem humanen Multi-Wirkstoffresistenz-Protein 1 (hMDR-1, P-gp) ist der Vorhersagewert dieser Methode für die Efflux-Transporterbindung beim Menschen hoch, was im Hinblick auf eine zukünftige klinische Anwendung günstig ist. Bisher wurde die Selektivität gegenüber anderen Efflux-Transportern jedoch nicht überprüft. Daher können andere Zelllinien verwendet werden, die verschiedene prominente Efflux-Transporter wie das Brustkrebsresistenzprotein (BCRP) oder das Multiple Resistenzprotein -1 (MRP-1) exprossen, um Wechselwirkungen zu diesen Transportern zu untersuchen. Die Methode ist im Vergleich zu klassischen Akkumulations- oder Transporttests sehr einfach und liefert sofort qualitative Ergebnisse. Darüber hinaus ist der größte Vorteil, dass diese Technologie die Bewertung der direkten Interaktion zwischen PET-Tracer und Ziel in Echtzeit ermöglicht, im Gegensatz zum konventionellen Experiment mittels indirekter Quantifizierung (meist Verschiebung). Darüber hinaus bietet die Echtzeit-Radioassay-Software experimentelle Flexibilität (z.B. Nuklidenzerfallskorrektur, Messzeit und Positionen, etc.) und damit hohe Freiheit für den Anwender. Auf der anderen Seite umfasst die Einschränkung der Methode einen niedrigen Probendurchsatz, da jeweils nur eine Zellschale gemessen werden kann. Darüber hinaus sollten einige andere technische und betriebliche Fragen berücksichtigt werden: Die beschriebene Technologie ist sehr empfindlich gegenüber Hintergrundstrahlung; Daher sollten Strahlungsquellen auf Distanz gehalten und der Schwerpunkt auf die Hintergrundmessung vor dem Experiment gelegt werden. Ein weiteres Problem bei Experimenten bei höheren Temperaturen als Raumtemperatur ist die Erwärmung der geneigten Stütze: Verdunstung des Zellkulturmediums könnte den Detektor beeinflussen. Anstelle des Erhitzens wird das gesamte Gerät vorzugsweise in den Inkubator gestellt. Darüber hinaus ist die Methode auf anhaftende Zelllinien beschränkt. Durch die Rotation der Zellkulturschale können sich spannungsempfindliche Zellen von der Schale lösen, was zu ungültigen Ergebnissen führen kann.
Dennoch liefert die Methode schnelle und zuverlässige Ergebnisse für die Analyse des kinetischen Verhaltens präklinischer PET-Tracer, wenn der Experimentator auf diese kleinen Nachteile achtet.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Wissenschaftsfonds (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser) unterstützt. Wir sind dankbar für die technische Unterstützung von T. Zenz und A. Krcal. Darüber hinaus danken wir K. Pallitsch für die Vorbereitung der AgOTf und H. Spreitzer für die Verteilung des Vorläufers.
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941 | |||
Ni catalyst | Shimadzu, Kyoto, Japan | Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh | |
Iodine | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04761.0100 | |
Acetonitrile | Merck, Darmstadt, Germany | for DNA synthesis, < 10 ppm H2O | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
Ammonium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | ||
Acetic acid | Merck, Darmstadt, Germany | glacial | |
Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 96% | |
NaCl | B. Braun, Melsungen, Germany | 0.9% | |
Tetrabutylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
SPE cartridge | Waters, Milford, MA, USA | SepPak C18plus | |
Semi-preparative RP-HPLC column | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm | |
Precolumn | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm | |
Precursor | University of Vienna, Austria | SNAP-acid | |
Reference compound | University of Vienna, Austria | SNAP-7941 | |
Silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
Graphpa GC | Alltech, Deerfield, IL, USA | 80/100 mesh | |
PET trace 860 cyclotron | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
[11C]CO2 high pressure target | Air Liquide, Vienna, Austria | ||
TRACERlabFX2 C | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
N2 + 1% O2 | Air Liquide, Vienna, Austria | Target gas | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941. | |||
Merck Hitachi LaChrom, L-7100 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) | HPLC pump | |
Merck Hitachi, L7400 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) | UV-detector | |
NaI-radiodetector | Raytest (Straubenhardt, Germany) | NaI-radiodetector | |
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm | Merck (Darmstadt, Germany) | HPLC column | |
430-GC | Bruker (Bremen, Germany) | Gas chromatograph | |
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm | SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) | Gas capillary | |
Wesco, osmometer Vapro 5600 | Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) | Osmometer | |
g-spectrometer | g-spectrometer | ||
Gas chromatography controlling software | VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) | Galaxie Version 1.9.302.952 | |
Gamma spectrometer controlling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Maestro for windows Version 6.06 | |
Gamma spectrum recalling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Winplots version 3.21 | |
HPLC controlling software | Raytest (Straubenhardt, Germany) | Gina Star Version 5.9 | |
inolab 740 | WTW (Weilheim, Germany) | pH meter | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941. | |||
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1) | |
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Wildtype (WT) | |
DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 10270-106 | |
Penicillin/Streptomycin | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 15140 | |
Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
In vitro experiments | |||
DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
(±)-Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | ||
DMSO | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | 276855-100 mL | |
Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
Sterile disposable plastic pipettes | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Sterilin, 5 mL – 25 mL | |
Sterile pipette tips | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL | |
Cell culture flasks | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175 | |
LigandTracer control Version 2.2.2 | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
LigandTracer Yellow | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
LigandTracer White | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software, Inc. | ||
Handheld automated Cell Counter | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter (Cat.No. PHC00000) | |
Cell Counter Sensors | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050) |