الجانب التقني من التوليف الآلي والتقييم الحركي في الوقت الحقيقي من [11C] SNAP-7941
Summary
هنا، نحن نمثل بروتوكولا لوضع العلامات الإشعاعية مؤتمتة بالكامل من [11C] SNAP-7941 وتحليل الحركية في الوقت الحقيقي من هذا PET-التتبع على P-GP التعبير عن الخلايا وعدم التعبير.
Abstract
التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) هو تقنية تصوير جزيئية أساسية توفر رؤى في المسارات وتستخدم الأربطة الإشعاعية المستهدفة المحددة للتحقيقات في الجسم الحي. ضمن هذا البروتوكول, يتم وصف التمثيل الإشعاعي قوية وموثوق بها للتحكم عن بعد من [11C] SNAP-7941, خصم لمستقبلات هرمون تركيز الميلانين 1. يبدأ التركيب الإشعاعي مع السيكلوترون المنتجة [11C] CO2 التي يتم في وقت لاحق مزيد من رد الفعل عبر انتقال مرحلة الغاز إلى [11C] CH3OTf. ثم، يتم إدخال هذا الوسيط التفاعلي إلى محلول السلائف ويشكل المتتبع الإشعاعي المعني. يتم تحديد المواد الكيميائية وكذلك النقاء الكيميائي الإشعاعي عن طريق RP-HPLC، التي تنفذ بشكل روتيني في عملية مراقبة الجودة الصيدلانية الإشعاعية. بالإضافة إلى ذلك، يتم حساب النشاط المولي كما هو ضرورة للتحقيقات الحركية في الوقت الحقيقي التالية. وعلاوة على ذلك، يتم تطبيق [11C] SNAP-7941 على خلايا MDCKII-WT وMDCKII-hMDR1 لتقييم تأثير التعبير عن البروتين السكري (P-gp) على تراكم الخلايا. لهذا السبب، يتم استخدام خط الخلية التعبير عن P-GP (MDCKII-hMDR1) إما دون أو مع حظر قبل التجارب عن طريق الركيزة P-GP (±)-verapamil وتقارن النتائج لتلك التي لوحظت لخلايا النوع البري. ويبين النهج التجريبي العام أهمية الإدارة الدقيقة للوقت التي تعتبر أساسية لكل دراسة قبل السريرية والسريرية باستخدام أجهزة تتبع PET ذات العلامات الإشعاعية مع النويدات قصيرة الأجل، مثل الكربون-11 (نصف العمر: 20 دقيقة).
Introduction
[11جيم] وقد تطورت SNAP-7941 كأول التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET)-التتبع التي تستهدف مستقبلات هرمون تركيز الميلانين 1 (MCHR1) – مستقبلات تشارك أساسا في التنظيم المركزي للشهية ولتناول الطعام1. الكربون-11 وضع العلامات من SNAP-7941، وهو خصم MCHR1 تتميز بشكلجيد، أسفرت عن أصيلة PET-التتبع 2،3،4،5. ومع ذلك، فإن التركيب الإشعاعي الآلي بالكامل يشكل تحديا ً كبيراً من حيث فعالية الوقت وقابلية التكرار مع النويدات المشعة القصيرة الأجل الكربون-11 التي تقدم نصف عمر 20 دقيقة6. وينبغي الإبقاء على الوقت الإجمالي للتوليف عند الحد الأدنى، وكقاعدة عامة ينبغي ألا يتجاوز نصف العمر 2-3 (أي حوالي 40-60 دقيقة بالنسبة للكربون -11)7. وعلى وجه الخصوص، يجب تحسين إجراءات التوليف للتتبعات الراديوية التي تستهدف أنظمة المستقبلات ذات الكثافات المنخفضة للتعبير على نطاق واسع للحصول على غلة كافية وبالتالي ارتفاع النشاط المولي8. يتبع الاستراتيجية اصطناعيّة غالبا النويدات إشعاعيّة إنتاج ضمن [سكلوترون] وإطلاق من [11[ك][ك]2 إلى المزج. هناك، يتم تخفيض [11C] CO2 أولا إلى [11C] CH4 وتتفاعل في وقت لاحق مع اليود لإنتاج [11C] CH3I عن طريق طريقة مرحلة الغاز9،10. مزيد من العلاج مع الغلة ترفلات الفضة [11C] CH3OTf مباشرة على الخط. وبعد ذلك، يُدخل هذا الكربون -11 المتفاعل المُصنّع على المتوسط في محلول يحتوي على جزيء السلائف. بالإضافة إلى ذلك، ينطوي التركيب الإشعاعي الآلي على عملية تنقية مع RP-HPLC شبه مُسبق، بما في ذلك التركيبة اللاحقة للمنتج المناسب للدراسات ما قبل السريرية والسريرية.
بغض النظر عن نصف عمر النويدات المشعة والجهد الزمني للتركيب الإشعاعي، فإن الدوائية للأدوية الإشعاعية هي الجزء الأكثر أهمية الذي يجب تقييمه أثناء تطوير PET-التتبع. من حيث التصوير العصبي، دخول الدماغ من PET-التتبع هو الشرط الأساسي. ومع ذلك، فإن حاجز الدم في الدماغ (BBB)، وهو “الحدود الأمنية” للدماغ، يعبر بشدة عن ناقلات efflux التي يمكن تفريغ جزيئات صغيرة (على سبيل المثال، PET-tracers) وتعوق بكفاءة إمكانية تطبيقها.
عيب كبير خلال التقييم قبل السريرية هي تفاعلات غير متوقعة نحو هذه الناقلين efflux، والتي غالبا ما تكون غير معترف بها في التجارب المختبرية ويؤدي إلى فشل PET-التتبع في الجسم الحي، كما لوحظ ل [11C] SNAP-7941. أظهر التصوير في الفئران انخفاض تراكم الدماغ، والتي زادت بشكل كبير بعد إعطاء مثبط P-GP tariquidar11. وتشير هذه البيانات إلى أن [11C] SNAP-7941 هو الركيزة من هذا النظام الناقل efflux عرقلة ربط ligand المركزية MCHR1. لسوء الحظ، لا يزال هناك نقص في النماذج الكافية في المختبر مما يتيح التنبؤ باختراق BBB في مرحلة مبكرة من تطوير التتبع.
هنا، ونحن نصف التوليف الآلي من [11C] SNAP-7941 باستخدام المزج لميثيلات الكربون-11. وينصب تركيز هذا العمل على تقديم لمحة عامة عن كيفية تنظيم نهج تجريبي متعاقب، بما في ذلك التوليف الآلي، ومراقبة الجودة، فضلا عن التقييم المتتالي في المختبر مع النويدات الكربونية -11 القصيرة الأجل جدا.
أولاً، يتم وصف الخطوات الرئيسية لنجاح التركيب الإشعاعي مع الحد الأدنى من النفقات الزمنية والغلة القصوى. ثم، يتم إعداد إجراء مراقبة الجودة موثوق بها مما يجعل المتتبع الإشعاعي المتاحة للدراسات السريرية المحتملة وتلبية معايير دستور الأدوية الأوروبي12. والتحديد الكمي لتركيز الأضراس وحساب النشاط المولي المعني هو شرط أساسي للقياسات الحركية المتعاقبة.
وأخيرا، يتم تقديم طريقة جديدة ومباشرة في المختبر تقييم [11C] SNAP-7941 التفاعلات نحو الناقل efflux، P-GP (hMDR1). يستخدم النموذج الحركي المقترح جهازًا سهل المقبض يسمح بتفسير فوري للبيانات ويتطلب الحد الأدنى من جهد زراعة الخلايا13.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أنشئ التركيب الإشعاعي لـ [11C] SNAP-7941 على وحدة تركيب تجارية. ونظرا لإمكانية التشغيل الآلي الكامل لإجراء الإعداد، فإن التركيب الإشعاعي الذي ثبت أنه موثوق به، وتحققت تحسينات فيما يتعلق بالحماية من الإشعاع للمشغل. إعداد المزج له تأثير هائل على نوعية المتتبع الإشعاعي، وخاصة من حيث النشاط المولي. وبالتالي، من الضروري العمل باستمرار في ظل ظروف خاملة (مثل الغلاف الجوي للهيليوم)، وشطف جميع الخطوط الموجودة قبل سفينة التفاعل (الخط المستهدف، [11C]CH3I دورة الإنتاج والمفاعل (انظر الشكل2)). وعلاوة على ذلك، تسخين الفخاخ والأفران ذات الصلة قبل بدء التوليف لإزالة الرطوبة والكربون في الغلاف الجوي يزيد من النشاط المولي بشكل مفيد. خصوصا العمود AgOTf، مشربة مع الكربون الجرافيت، حساسة للغاية للرطوبة. حتى كميات طفيفة من أي مصدر للرطوبة يزعج تحويل [11C] CH3I إلى [11C] CH3OTf. قبل البدء في التوليف، و [11C] CO2 فخ و [11C] CH3فخ يجب أن يبرد إلى درجة حرارة الغرفة مرة أخرى من أجل تمكين المحاصرين اللاحقة. وعلاوة على ذلك، يوصى بحل السلائف قبل وقت قصير من بدء التوليف وإضافة القاعدة مباشرة إلى محلول السلائف.
يجب أن تكون مراقبة الجودة لـ carbon-11 radiotracers مصممة بشكل رشيد لسير عمل مستمر وسريع. ومع ذلك، فإن أهم المعلمات لدراسات زراعة الخلايا هي النقاء الكيميائي الإشعاعي والنشاط المولي للحصول على نتائج صحيحة. يتطلب التقييم الصحيح للنشاط المولي طريقة تحليلية قوية HPLC ومنحنى المعايرة يجب أن يغطي نطاق تركيز المنتج النهائي. والجزء الصعب بالنسبة للأجهزة الراديوية هو تحقيق تركيز يتجاوز الحد الأقصى للقياس الكمي (LOQ) بسبب كميات صغيرة، يتم إنتاجها أثناء التركيب الإشعاعي. وبالتالي، فإن الفن هو العثور على التوازن بين الأنشطة الموليعالية لتجنب تشبع مستقبلات وتركيزات عالية بما فيه الكفاية لتكون لا تزال قادرة على تحديد كمية الإشارة غير المشعة.
[11جيم] تم تأكيد SNAP-7941 لتكون الركيزة قوية من الناقل P-GP الإنسان، كما لوحظ أي تراكم في الخلايا MDCKII-hMDR1 غير المعالجة أو المركبات بسبب efflux السريع. وعلى النقيض من ذلك، فإن كلا ً من اللإعدادات التجريبية (MDCKII-WT أو خلايا MDCKII-hMDR1 المحظورة مسبقًا) قدمت نتائج مماثلة (تراكم [11C]SNAP-7941)، مما يدعم تعدد استخدامات هذا الاختبار في المختبر. خلايا MDCKII-hMDR1 هي مناسبة للغاية لتجارب LigandTracer بسبب الانفذيب مستقرة، والنمو السريع والمستمرة ضد الإجهاد القص الناجم ة عن طبق ثقافة الخلية الدورية. وبالتالي فإن عدم وجود [11C] SNAP-7941 التناول في الدماغ الفئران والفئران قد يحدث بسبب efflux من خلال الناقل P-GP. بسبب الانجراف من خلايا الكلى الكلاب مع البروتين المقاومة للأدوية المتعددة البشرية 1 (hMDR-1، P-GP)، والقيمة التنبؤية لهذه الطريقة لefflux الناقل ملزمة في البشر عالية، وهو أمر إيجابي من حيث التطبيق السريري في المستقبل. ومع ذلك، لم يتم التحقق حتى الآن من الانتقائية ضد الناقل efflux الأخرى. لذلك، يمكن استخدام خطوط الخلايا الأخرى، والتعبير عن مختلف ناقلات efflux بارزة كما بروتين مقاومة سرطان الثدي (BCRP) أو البروتين المقاومة متعددة-1 (MRP-1)، لدراسة التفاعلات نحو هذه الناقلين. الأسلوب بالمقارنة مع تراكم الكلاسيكية أو النقل الاختبارات بسيطة جدا ويعطي نتائج نوعية على الفور. وعلاوة على ذلك، فإن أكبر ميزة هي أن هذه التكنولوجيا تمكن من تقييم التفاعل المباشر بين متتبع PET والهدف في الوقت الحقيقي، على النقيض من التجربة التقليدية باستخدام القياس الكمي غير المباشر (الإزاحة في الغالب). وبالإضافة إلى ذلك، يوفر برنامج التشعاع الإشعاعي في الوقت الحقيقي مرونة تجريبية (مثل تصحيح اضمحلال النويدات، وقياس الوقت والمواقف، وما إلى ذلك) وبالتالي، حرية عالية للمستخدمين. على الجانب الآخر، تشمل قيود الطريقة انخفاض الإنتاجية عينة، كما يمكن قياس طبق خلية واحد فقط في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار بعض المسائل التقنية والتشغيلية الأخرى: فالتكنولوجيا الموصوفة حساسة جدا للإشعاع الخلفي؛ والتكنولوجيا الموصوفة حساسة جدا إزاء الإشعاع الخلفي؛ والتكنولوجيا الموصوفة حساسة جدا إزاء الإشعاع الخلفي؛ والتكنولوجيا الموصوفة حساسة جدا إزاء الإشعاع الخلفي؛ والتكنولوجيا الموصوفة حساسة جدا للإشعاع اتلاف. وبالتالي، ينبغي الإبقاء على مصادر الإشعاع عن بعد، وينبغي التركيز على قياس الخلفية قبل التجربة. وثمة مسألة أخرى تتعلق بالتجارب في درجات حرارة أعلى من درجة حرارة الغرفة، وهي تسخين الدعم المائل: قد يؤثر تبخر وسيلة ثقافة الخلية على الكاشف. بدلا من التدفئة، ويفضل أن يتم وضع الجهاز كله في الحاضنة. وعلاوة على ذلك، يقتصر الأسلوب على خطوط الخلايا الملتصقة. من خلال دوران طبق ثقافة الخلية، قد تنفصل الخلايا الحساسة عن الطبق، مما قد يؤدي إلى نتائج غير صالحة.
ومع ذلك، إذا كان المُجرِّب يعيّن الاهتمام بهذه العيوب الطفيفة، فإن ّ الأسلوب يقدّم نتائج سريعة وموثوقة لتحليل السلوك الحركي لـ PET-tracers قبل السريرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل صندوق العلوم النمساوي (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser). ونحن ممتنون للدعم التقني الذي تقدمه ت. زنز وأ. كركال. وعلاوة على ذلك، نشكر ك. باليتش على إعداد الفريقين وشركة H. Spreitzer لتوزيعهما السلائف.
Materials
| Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941 | |||
| Ni catalyst | Shimadzu, Kyoto, Japan | Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh | |
| Iodine | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04761.0100 | |
| Acetonitrile | Merck, Darmstadt, Germany | for DNA synthesis, < 10 ppm H2O | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
| Ammonium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | ||
| Acetic acid | Merck, Darmstadt, Germany | glacial | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 96% | |
| NaCl | B. Braun, Melsungen, Germany | 0.9% | |
| Tetrabutylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
| SPE cartridge | Waters, Milford, MA, USA | SepPak C18plus | |
| Semi-preparative RP-HPLC column | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm | |
| Precolumn | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm | |
| Precursor | University of Vienna, Austria | SNAP-acid | |
| Reference compound | University of Vienna, Austria | SNAP-7941 | |
| Silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Graphpa GC | Alltech, Deerfield, IL, USA | 80/100 mesh | |
| PET trace 860 cyclotron | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
| [11C]CO2 high pressure target | Air Liquide, Vienna, Austria | ||
| TRACERlabFX2 C | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
| N2 + 1% O2 | Air Liquide, Vienna, Austria | Target gas | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941. | |||
| Merck Hitachi LaChrom, L-7100 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) | HPLC pump | |
| Merck Hitachi, L7400 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) | UV-detector | |
| NaI-radiodetector | Raytest (Straubenhardt, Germany) | NaI-radiodetector | |
| Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm | Merck (Darmstadt, Germany) | HPLC column | |
| 430-GC | Bruker (Bremen, Germany) | Gas chromatograph | |
| Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm | SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) | Gas capillary | |
| Wesco, osmometer Vapro 5600 | Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) | Osmometer | |
| g-spectrometer | g-spectrometer | ||
| Gas chromatography controlling software | VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) | Galaxie Version 1.9.302.952 | |
| Gamma spectrometer controlling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Maestro for windows Version 6.06 | |
| Gamma spectrum recalling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Winplots version 3.21 | |
| HPLC controlling software | Raytest (Straubenhardt, Germany) | Gina Star Version 5.9 | |
| inolab 740 | WTW (Weilheim, Germany) | pH meter | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941. | |||
| Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1) | |
| Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Wildtype (WT) | |
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 15140 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
| In vitro experiments | |||
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
| (±)-Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | ||
| DMSO | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | 276855-100 mL | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
| Sterile disposable plastic pipettes | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Sterilin, 5 mL – 25 mL | |
| Sterile pipette tips | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175 | |
| LigandTracer control Version 2.2.2 | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| LigandTracer Yellow | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| LigandTracer White | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software, Inc. | ||
| Handheld automated Cell Counter | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter (Cat.No. PHC00000) | |
| Cell Counter Sensors | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050) |
References
- Saito, Y., Maruyama, K. Identification of melanin-concentrating hormone receptor and its impact on drug discovery. Journal of Experimental Zoology. 305, 761-768 (2006).
- Philippe, C., et al. Preclinical in vitro & in vivo evaluation of [11C]SNAP-7941 – the first PET tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1. Nuclear Medicine and Biology. 40, 919-925 (2013).
- Philippe, C., et al. Radiosynthesis of [ 11C]SNAP-7941-the first PET-tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1 (MCHR1). Applied. Radiation and Isotopes. 70, 2287-2294 (2012).
- Philippe, C., et al. SNAPshots of the MCHR1 : a Comparison Between the PET-Tracers [ 18 F ] FE @ SNAP and [ 11 C ] SNAP-7941. Molecular Imaging Biology. , 1-12 (2018).
- Schirmer, E., et al. Syntheses of precursors and reference compounds of the melanin- concentrating hormone receptor 1 (MCHR1) Tracers [11C]SNAP-7941 and [18F]FE@SNAP for positron emission tomography. Molecules. 18, 12119-12143 (2013).
- Miller, P. W., Long, N. J., Vilar, R., Gee, A. D. Synthese von 11C-, 18F-, 15O- und 13N-Radiotracern für die Positronenemissionstomographie. Angewandte Chemie. 120, 9136-9172 (2008).
- Pichler, V., et al. An overview on PET radiochemistry: part 1 – covalent labels – 18 F, 11 C, and 13 N. Journal of Nuclear Medicine. 59, 1350-1354 (2018).
- Pichler, V., et al. Molar activity – The keystone in 11C-radiochemistry: An explorative study using the gas phase method. Nuclear Medicine and Biology. 67, 21-26 (2018).
- Larsen, P., Ulin, J., Dahlstrøm, K., Jensen, M. Synthesis of [11C]iodomethane by iodination of [11C]methane. Applied Radiation and Isotopes. 48, 153-157 (1997).
- Dahl, K., Halldin, C., Schou, M. New methodologies for the preparation of carbon-11 labeled radiopharmaceuticals. Clinical and Translational Imaging. 5, 275-289 (2017).
- Raaphorst, R. M., et al. Radiopharmaceuticals for assessing ABC transporters at the blood-brain barrier. Clinical. Pharmacollogy & Therapeutics. 97, 362-371 (2015).
- Nics, L., et al. Speed matters to raise molar radioactivity: Fast HPLC shortens the quality control of C-11 PET-tracers. Nuclear Medicine and Biology. 57, 28-33 (2018).
- Zeilinger, M., et al. New approaches for the reliable in vitro assessment of binding affinity based on high-resolution real-time data acquisition of radioligand-receptor binding kinetics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging (Research). 7, 22 (2017).
