Aspect technique de la synthèse automatisée et de l'évaluation cinétique en temps réel de [¹¹C]SNAP-7941

CAUTION: Dans le protocole suivant sont multiples étapes impliquées qui nécessitent la manipulation et la manipulation de la radioactivité. Il est important que chaque étape soit en accord avec le Département de la sécurité des radiations de l’institut et la législature nationale concernée. Il est obligatoire de minimiser l’exposition aux rayonnements ionisants pour les opérateurs concernés suivant le principe ALARA («As Low As Reasonably Achievable»). 1. Gestion du temps et planification de l’expérience REMARQUE : La courte demi-vie du carbone-11 nécessite une gestion précise du temps pour minimiser la perte de radioactivité (figure 1). Il est important que toute personne concernée connaisse son domaine de responsabilité et le moment de l’action respective. Pour la mise en place d’une expérience cinétique en temps réel de [11C]SNAP-7941, environ quatre personnes sont nécessaires pour un processus en douceur. Organisez un producteur pour [11C]SNAP-7941. Informez l’opérateur de contrôle de la qualité effectuant l’évaluation de spécification, le calcul de la concentration de masse et l’activité molaire de l’heure de début de synthèse. Tenez l’expérimentateur cinétique en temps réel prêt pour le calcul de dilution et l’exécution de l’expérience. Instruire le coureur pour le transfert de la radioactivité à la place respective au moment où. 2. Synthèse automatisée de [11C]SNAP-7941 pour une utilisation préclinique Préparation du synthétiseur (figure 2). Allumez le synthétiseur, les gaz techniques requis (hélium et hydrogène) et le logiciel de contrôle du synthétiseur Tracerlab. Sélectionnez le snapde séquence de synthèse respectif . Laver V1-V3 une fois avec de l’eau et deux fois avec de l’acétone via le réacteur et la valve HPLC soit sur la charge ou d’injecter la position dans la bouteille de déchets boucle. Séchez toutes les lignes associées à l’entrée et à l’extérieur du réacteur par l’intermédiaire de la soupape d’injection avec un flux continu d’hélium activé par V18. Chauffez le piège [11C]CH3I ainsi que le piège [11C]CH3OTf sous un flux d’hélium de 100 ml-min-1 jusqu’à 200 oC via V24, V25, V29, V15, V9, V17 et V32/V33 avec réacteur détaché. Vérifiez la même voie pour les fuites (avec réacteur attaché) avec un débit d’hélium de 100 mL-min-1. L’étanchéité est garantie lorsque le débit tombe en dessous de 4 mLmin-1. Allumez la pompe HPLC (5-10 mL-min-1) et lavez les lignes HPLC et la valve d’injection avec de l’acétonitrile/eau (50/50, v/v) ainsi que les lignes HPLC avec le solvant HPLC via V14 dans l’ampoule. Videz l’ampoule via V11 et V12 dans la bouteille de déchets avec un flux d’hélium via V19. Laver les lignes respectives avec de l’eau de V6 à nouveau via V11 et V12 avec un flux d’hélium via V18. Laver V5 avec de l’éthanol et V4 avec de l’eau via V11 et V12 dans le flacon de collecte du produit (PCV) à l’aide d’un flux d’hélium via V18, puis vider le PCV via V13 dans la bouteille de déchets avec un flux d’hélium via V20. Éteignez la pompe HPLC, passez au solvant pour la synthèse (acétate d’ammonium (2,5 g L-1)/acide acétique 97,5/2,5 v/v; pH 3.5)/acetonitrile 75/25 v/v), attacher la colonne semi-préparative HPLC et réquiliber la colonne (flux de 5 mL-min-1). Remplissez les réactifs pour la synthèse et la purification : 1,5 ml d’eau (V2), 4,5 ml de 0,9 % NaCl (V4), 0,5 ml d’éthanol à 96 % (V5), 10 ml d’eau (V6) et 90 ml d’eau (ampoule). Attachez une nouvelle fiole de déchets de boucle; une flacon de produit (étiqueté et équipé d’une aiguille d’aération) à V13 et à l’azote liquide. Préconditionner une cartouche SPE (extraction en phase solide) avec 10 ml d’éthanol à 96 % et 20 ml d’eau et l’attacher entre Le V11 et le V12. Démarrer la séquence pré-course 20 min avant de commencer la synthèse, consistant à chauffer le piège[11C]CO2 à 400 oC et à rincer le piège avec un flux d’hélium de 50 mlmin-1via V27 (2 min). Ensuite, pré-rincer le piège [11C]CO2 pendant 3 min avec de l’hydrogène gazeux (120 mL-min-1) et enfin refroidir à moins de 40 oC. Dissoudre 1 mg de précurseur dans 400 l d’acétonitrile (pour la synthèse de l’ADN, lt; 10 H2O), transférer la solution à la réaction et ajouter 5,5 l de TBAH (264 mg-mL-1 en méthanol). Attachez le réacteur à sa position respective. Fermer la cellule chaude et allumer la pression de la cellule chaude. Confirmer le début du processus de refroidissement du piège CH4 avec de l’azote liquide à -75 oC. Relâchez la radioactivité lorsque la température est atteinte. Production de Cyclotron de [11C]CO2REMARQUE : Les étapes 2.2.1-2.2.4 sont effectuées simultanément à la préparation du module de radiosynthèse (voir aussi Figure 1). Allumez l’aimant du cyclotron. Sélectionnez la cible 11C-CO2 et démarrez le faisceau 65 A. Confirmer le début de l’irradiation en appuyant sur le bouton Démarrer l’irradiation Arrêter le faisceau et confirmer la libération de radioactivité dans le synthétiseur en appuyant sur le bouton Livraison, après la quantité désirée de radioactivité est atteint (environ 120 GBq après 30 min). Exécution de la radiosynthèse entièrement automatisée Confirmer que le système est prêt à recevoir la radioactivité et à démarrer le processus automatisé Suivi du processus automatisé suivant. Vérifier si le [11C]CO2 est automatiquement transféré du cyclotron dans l’unité de synthèse via V26 (environ 4 min) et que le [11C]CO2 est piégé sur le tamis moléculaire imprégné de nickel comme catalyseur ([ 11 Ans, états-unis ( Piège C]CO2) à température ambiante. Suivre si le piège [11C]CO2 est automatiquement rincé d’abord avec de l’hélium (50 mLmin-1) puis avec de l’hydrogène gazeux (120 mL-min-1). Ensuite, observez que le V27 et le V25 sont fermés et que le[11C]CO2, y compris l’hydrogène, est chauffé à 400 oC et que le [11 C]CH4 formé est transporté vers le [11 C]CH4 piège et pris au piège là-bas. Surveiller que V10 est fermé, V9 ouvert (vers la colonne d’iode) et [11C]CH4 est à nouveau libéré en chauffant le [11C]CH4 piège lentement à 80 oC et transporté dans l’unité de circulation avec un flux d’hélium via V10 (sortie d’échappement). Et vérifiez encore si [11C]CH4 est converti en [11C]CH3I dans l’unité de circulation, qui durent environ 3 min et la formation [11C]CH3Je suis continuellement piégé sur le [11C] CH3Je piège. Assurez-vous que la soupape d’échappement V16 est ouverte et que le piège[11C]CH3I est chauffé à 90 oC avec un jet d’hélium (20 mLmin-1) via V24. Par la présente, les sous-produits possibles sont enlevés, puis V16 est fermé. Confirmez que le[11C]CH3I est prêt à être libéré dans le réacteur. Surveillez le processus automatisé suivant : Vérifiez si le piège[11C]CH3I est chauffé à 190 oC et que le[11C]CH3i est libéré dans le réacteur par le piège[11C]CH3OTf (V32 et V33, toujours à 200 ‘ C), V7 et V8 sous un flux continu d’hélium (10-25 mL-min-1, V24). Au cours de ce processus, V21 et V23 (sortie d’échappement) doivent être ouverts. Confirmez que la radioactivité est arrivée dans le réacteur, une fois que la quantité de radioactivité dans le réacteur ne augmente plus. Suivi du processus automatisé suivant et préparation à l’intervention manuelle, si nécessaire Vérifiez si les V23, V21 et V8 sont automatiquement fermés et que le mélange de réaction est chauffé à 75 oC. Après 3 min, observez si le réacteur est refroidi avec de l’azote liquide jusqu’à ce que la température soit inférieure à 35 oC. Par la suite, assurez-vous que le mélange de réaction est éteint avec 1,5 ml d’eau via V2. Au cours de ce processus, V21 et V23 (sortie d’échappement) doivent être ouverts. Suivi si le V21 et le V23 sont fermés et si le mélange de réaction est transféré à la soupape d’injection HPLC en passant par un détecteur de fluide dans la boucle HPLC (5 ml). Suivez si le mélange de réaction est automatiquement injecté sur la colonne HPLC. Observez le chromatogramme et coupez manuellement le pic du produit via le bouton Peak start. Appuyez sur La fin du pic lorsque le signal de pointe du produit tombe en dessous d’environ 400 cps après un temps de rétention d’environ 8-10 min (flux: 5 mL-min-1, Figure 3). Allumez un flux d’hélium supplémentaire pour accélérer la vidange de l’ampoule. Surveiller si l’ampoule se vide et observer la bouteille de déchets: Vérifiez si l’ampoule est vidée via V11, la cartouche SPE et V12 dans les déchets avec un flux d’hélium via V19 et une ligne d’hélium supplémentaire et si le produit conserve sur la cartouche SPE. Confirmez que l’ampoule est complètement vide. Suivi du processus automatisé de purification sPE et de transfert de produit Vérifiez si la cartouche SPE est lavée avec 10 ml d’eau via V6, V11 et V12 dans les déchets et si l’éthanol élute le produit dans le PCV via V5, V11 et V12. Enfin, observez si 0,9% de NaCl est ajouté au PCV via V4, V11 et V12 pour diluer le produit. Assurez-vous que la solution de produit est transférée via V13 et un filtre stérile dans le flacon de produit final avec un flux d’hélium via V20. Confirmer que le produit a été complètement transféré. 3. Contrôle de la qualité (QC) REMARQUE : Le contrôle de la qualité des produits radiopharmaceutiques comprend la mesure des paramètres suivants : Pureté radiochimique et activité molaire (RP-HPLC) Solvants résiduels (chromatographie gazeuse, GC) Osmolalité (osmomètre de pression de vapeur) pH (pH-mètre) Pureté du spectre/radionucléide (spectromètre) Demi-vie/pureté radionucléide (étalonneur de dose) Tous les paramètres physico-chimiques sont déterminés avant la sortie du produit et les valeurs doivent être dans la plage de paramètres de qualité définie. Préparation de l’équipement de contrôle de la qualité Démarrer la préparation 30 min avant la fin de la synthèse. Préparer une fiole conique dans un contenant protégé en plomb et une seringue de 1 ml avec une aiguille attachée. Préparer une solution standard de référence de SNAP-7941 (10 ‘g’mL-1) dans l’eau pour HPLC. Allumez le pH mètre, le chromatographe à gaz et les gaz utilisés, l’osmomètre et tous les composants du HPLC. Activez le logiciel de contrôle HPLC et sélectionnez la colonne dédiée et la méthode respective pour [11C]SNAP-7941 (phase mobile : (eau/acide acétique 97,5/ 2,5 v/v; 2,5 g.L-1 ammonium acétate; pH 3.5)/acetonitrile 70/30 v/v; flux: 1 mL-min -1) ) et rédiger une liste d’échantillons avec deux mesures (standard et produit). Démarrer la méthode de conditionnement de la colonne. Injectez 20 l de la solution de référence SNAP-7941 avec une seringue Hamilton après 10 min de conditionnement et commencez la course d’analyse. Laver la seringue Hamilton deux fois avec de l’acétonitrile et de l’eau après l’injection. Démarrez le logiciel de contrôle GC et écrivez la liste d’échantillons. Exécution du contrôle de la qualité Mesurer le rendement radioactif absolu du produit après la fin de la synthèse et transférer 100 l du produit dans une fiole de réaction avec la seringue à protection de plomb préparée pour le contrôle de la qualité.REMARQUE : Toutes les données obtenues à partir du contrôle de la qualité doivent être documentées conformément à la réglementation nationale. Analyse HPLC: Mesurer la pureté radiochimique et la pureté chimique et informer la personne en charge des expériences de culture cellulaire immédiatement des résultats. Dessinez 40 ll de l’échantillon QC et injectez au HPLC. Commencez la course en déplaçant le bras de la valve d’injection de la charge à l’injection (Figure 3). REMARQUE : Pendant la course (8 min), d’autres mesures du protocole peuvent être effectuées pour éviter autant de carie que possible. Ouvrez le chromatogramme et intégrez tous les pics dans le canal de radioactivité. Comparez le temps de rétention du produit (5,0-7,0 min) avec le temps de rétention de la norme de référence. Comparez la zone sous la courbe en pourcentage de tous les pics intégrés. Le pic du produit doit être de plus de 95% (pureté radiochimique) des zones intégrées totales (canal radio). Intégrer le signal dans le canal UV pour déterminer la pureté chimique. L’impureté principale est habituellement l’acide PRÉCURSEUR de SNAP à 2.8-3.5 min. La concentration de[natC]SNAP-7941 est calculée à partir de la courbe d’étalonnage après l’intégration. Calculez la concentration de SNAP-7941 dans ‘mol’mL-1 et déterminez l’activité molaire au moyen de l’équation suivante : Pour la chromatographie gazeuse, transférer 20 lL de l’échantillon de contrôle de la qualité dans un flacon de verre dédié. Placez-le dans l’autosampler et commencez la mesure. Une fois la mesure terminée, ouvrez le chromatogramme et notez le nombre de pics automatiquement intégrés. L’échantillon ne doit pas contenir plus de 410 ppm d’acétonitrile et 10 % d’éthanol. Osmolalité : Placez un disque d’échantillon de papier sur le creux dédié et appliquez 10 L de l’échantillon. Appuyez sur le bouton Fermer pour mesurer l’osmolalité. Après 3 min, l’appareil affiche l’osmolalité qui doit être dans une gamme de 190-500 mosm-kg-1. pH: Laver l’électrode avec de l’eau. Mesurer le pH en mettant l’électrode dans l’échantillon. Le pH doit être dans une gamme de 5.0-8.5. Laver l’électrode à nouveau après la mesure et placer l’électrode dans la solution de pH de référence. Spectre : Placez l’échantillon de QC dans le spectromètre, ouvrez le logiciel de contrôle et commencez la mesure. Arrêtez la mesure et notez l’énergie mesurée qui doit être 511 keV (gamme 420-520 keV). Ouvrez le menu de fichier et sécurichez le fichier avec le numéro de lot respectif. Rappelez le spectre enregistré dans le logiciel dédié et imprimez le spectre. Demi-vie : Mesurez l’activité de l’échantillon de QC deux fois en utilisant le calife de dose. Notez les temps respectifs et calculez la demi-vie de l’exponentiel. relâcher Après que tous les paramètres ont été testés et les résultats sont conformes aux directives des autorités autrichiennes, libérer le radiotracer. L’opérateur doit signer la justesse des données. 4. Évaluation des interactions envers le transporteur P-gp Culture cellulaire Démarrer le flux d’air laminaire (LAF) de l’établi et nettoyer le banc au moins 15 minutes avant de commencer à travailler. Mélanger le milieu de culture cellulaire dans des conditions stériles dans le LAF avec 10% de FCS (50 ml) et 0,5% des antibiotiques (2,5 ml) avec une pipette volumétrique stérile à l’aide d’une aide automatisée de pipetage. Décongeler les cellules MDCKII-hMDR1 et MDCKII-WT et cultiver dans un flacon de culture cellulaire T75 ou T175 10-14 jours avant les expériences dans des conditions aseptiques (LAF). Changer le milieu le lendemain pour enlever toutes les cellules non adhérentes et apoptotiques. Remplacer tous les trois jours le milieu par un milieu frais (12 ml pour le T75 et 23 ml pour le flacon de culture cellulaire T175, respectivement). Divisez les cellules selon le calendrier des expériences en flacons frais ou en plats de culture cellulaire sur une confluence de 80 % pour éviter la croissance des bicouches. Préparation cellulaire pour les expériences Diviser les cellules deux jours avant les expériences et les graines dans une concentration de 2,5 x 105 cellules par 2 ml dans un plan oblique d’un plat de culture cellulaire (Figure 4). Utilisez un dispositif de compteur cellulaire automatique ou une chambre de comptage Neubauer pour compter les cellules et calculer le rapport de fractionnement approprié. Retirez le milieu un jour avant les expériences, lavez les cellules sur le plat de culture avec 4 ml de DPBS et ajoutez 5 ml frais de milieu de culture cellulaire. Placer le plat horizontalement dans l’incubateur. Laver les cellules avec DPBS au moins 0,5 h avant les expériences et remplacer par 2 ml de milieu libre FBS. Examiner la confluence et la morphologie cellulaire au microscope. Effectuer les expériences dans trois configurations différentes. Utilisez le plat Petri pour les expériences décrites dans 4.2.3. Traiter les cellules pendant 0,5 h avant d’expérimenter avec 10 m d’hydrochlorure de verapamil. Ajouter 0,98 L de récurage de verapamil (20,4 mM d’hydrochlorure de verapamil dans le DMSO). La teneur finale en DMSO est de 0,05 % pendant le traitement. Incuber les cellules pendant 0,5 h avec le contrôle du véhicule (DMSO). Utilisez le même volume que celui utilisé pour le traitement médicamenteux. Expériences de l’exemple en temps réel (pour les trois configurations) Allumez l’appareil, l’ordinateur et assurez-vous qu’ils sont correctement connectés, puis ouvrez le logiciel de contrôle. Choisissez l’option Une cible, déverrouillez le modèle et ajustez le paramètre suivant :Nombre de postes: 2 (deux)Temps de détection (sec): 3 (3)Temps de retard de détection (s): 2 (deux)Nom de la première phase : ligne de base Insérez le plat de culture cellulaire dans le support incliné de l’appareil, en vous assurant que le pôle cellulaire est sur le côté inférieur et recouvert d’un milieu de culture cellulaire. Démarrez la course via le bouton Démarrer. Le système demande d’enregistrer le fichier. Choisissez un nom de fichier et un chemin d’enregistrement. Le centre de contrôle apparaît et la mesure de base commence (le support de plat de culture cellulaire commence à tourner). Sélectionnez sous Autres options:Échelle de temps : minutesCorrection du nucléide : carbone-11 Cochez toutes les cases sous Courbes en graphique (arrière-plan (rouge), cible (bleu) et cible moins arrière-plan (noir)). Obtenir des paramètres de contrôle de la qualité : l’activité molaire [GBq.-mol-1] et la concentration d’activité [MBq.mL-1] à la fin de la synthèse. Calculer le volume traceur respectif pour 15 nM de[natC]SNAP-7941 dans le volume d’analyse de 2 mL. Préparer la pipette au volume respectif et un aliquot du produit [11C]SNAP-7941 dans un blindage au plomb. Cliquez sur Pause exécuter dans la fenêtre du centre de contrôle. Attendez jusqu’à ce que la rotation du plat s’arrête et la barre latérale avec le titre Paused et la prochaine phase se produisent. Ouvrez le couvercle de l’appareil cinétique en temps réel. Tourner le support de plat de culture 90 vers la gauche. Ajouter le volume calculé de traceur et revenir à la position initiale. Ensuite, fermez le couvercle de l’appareil. Appuyez immédiatement sur le bouton Continuer pour démarrer l’expérience. Terminez l’expérience après 20 minutes en sélectionnant la pause et terminez ensuite la course (appuyez sur End run dans la barre latérale). Analyse et traitement des données à l’aide d’un logiciel statistique Ouvrez le logiciel de contrôle en temps réel. Cliquez sur les fichiers ouverts pour rappeler la cinétique requise. La cinétique est illustrée dans la fenêtre du centre de contrôle. Choisissez en cliquant à droite directement sur les courbes d’exportationcinétique . Enregistrer le fichier texte contenant les données brutes. Ouvrez le programme de statistiques et collez le fichier de données brutes des expériences en temps réel. Commencez par le temps (x-axe) à l’ajout de radiotracer (exclure la mesure de fond) et normalisez pour pourcentage le signal de la SCP maximale (compte par seconde). Chargez toutes les données normalisées vers un nouveau fichier GraphPad Prism. Calculer les valeurs moyennes et l’écart type. Illustrer les données obtenues comme graphique montrant l’écart (taux d’augmentation) de l’étude des traceurs des trois configurations.