^[11C]SNAP-7941の自動合成とリアルタイム運動評価の技術的側面

注意: 次のプロトコルでは、放射能の処理と操作を必要とする複数の手順が含まれます。すべてのステップは、研究所の放射線安全部とそれぞれの国の立法府と一致することが重要です。ALARA(「合理的に達成可能なほど低い」)の原則に従って関与するオペレータのための電化放射線への露出を最小限に抑えることが義務付けられています。 1. 時間管理と実験の計画 注:カーボン-11の短い半減期は、放射能の損失を最小限に抑えるために正確な時間管理を必要とします(図1)。関係者は、責任の領域とそれぞれの行動の時点を知ることが重要です。[11C]SNAP-7941のリアルタイム運動実験のセットアップには、スムーズなプロセスのために約4人が必要です。 [11C]SNAP-7941のプロデューサーを編成します。 仕様評価を行う品質管理事業者に、合成開始時間の質量濃度及びモル活性の算出を行う。 希釈計算の準備ができて、リアルタイムの運動実験者を保持し、実験を実行します。 各時点でそれぞれの場所に放射能を転送するようにランナーに指示する。 2. 前臨床用[11C]SNAP-7941の自動合成 シンセサイザーの調製(図2)。 シンセサイザー、必要な技術的ガス(ヘリウムと水素)とシンセサイザー制御ソフトウェアトレーサーラボをオンにします。それぞれの合成シーケンススナップを選択します。 V1-V3を水で1回、アセトンを介してアセトンで2回、ロードまたはループ廃棄物ボトルに位置を注入します。 V18を介して活性化された連続ヘリウムの流れと注入弁を介して反応器の出入りのすべての関連するラインを乾燥させる。 [11 C]CH3I トラップと同様に、100mL·min-1のヘリウムストリーム下でトラップを V24、V25、V29、V15、V9、V17、V32/V33 を切り離した原子炉で加熱します。 100 mL·min-1のヘリウム流れで(付属の原子炉で)漏れのための同じ経路を確認してください。流れが4 mL・分-1を下回るとき締め付けは保証される。 HPLCポンプ(5-10 mL·min-1)をオンにし、HPLCラインと注入弁をアセトニトリル/水(50/50、v/v)で洗浄し、V14を介してHPLC溶媒を使用したHPLCラインを電球に入れます。 V11とV12を介して電球をV19経由でヘリウムストリームで廃棄物ボトルに空にします。V11とV12を介してV6からの水でそれぞれのラインをV18経由でヘリウムストリームで再び洗浄します。 V11とV12を介してエタノールとV4でV5を洗浄し、V18経由でヘリウムストリームを使用して製品コレクションバイアル(PCV)にPCVを使用して、V20経由でヘリウムストリームで廃棄物ボトルにV13を介してPCVを空にします。 HPLCポンプをオフにし、合成用溶媒に切り替える(アセテート(2.5g·L-1)/酢酸 97.5/2.5 v/v;pH 3.5)/アセトニトリル75/25v/v)を、半準備HPLCカラムを取り付け、カラムを平衡化する(5 mL·min-1の流れ)。 合成精製用試薬を充填する:水1.5mL(V2)、4.5mLの0.9%NaCl(V4)、96%エタノール(V5)の0.5mL、10mLの水(V6)、90mLの水(球根)を充填します。 新しいループ廃棄物バイアルを取り付けます。V13および液体窒素への製品バイアル(標識され、通気針が装備されている)。 96%エタノールと20 mLの水の10 mLのSPE(固相抽出)カートリッジを予め条件付けし、V11とV12の間に取り付けます。 合成を開始する前に20分前に実行シーケンスを開始し、[11C]CO2トラップを400°Cに加熱し、V27(2分)を介して50 mL·min-1のヘリウムストリームでトラップを洗い流します。 その後、水素ガス(120mL·min-1)で3分間[11C]CO2トラップを予水し、最後に40°C以下まで冷却します。 アセトニトリルの400μLで前駆体の1mgを溶解し(DNA合成、<10H2O)、溶液を反応に移し、TBAHの5.5μLを加える(メタノールに264mg·mL-1)。原子炉をそれぞれの位置に取り付けます。 ホットセルを閉じ、ホットセルの下圧をオンにします。 液体窒素でCH4トラップの冷却プロセスの開始を-75°Cに確認します。 温度に達したら放射能を放出します。 [11C]CO2のサイクロトロン生産注: 手順 2.2.1-2.2.4 は、放射合成モジュールの調製に同時に行われます (図 1も参照)。 サイクロトロンの磁石をオンにします。 ターゲット11C-CO2を選択し、ビーム65 μAを開始します。 ボタンを押して照射開始を確認する ビームを停止し、ボタンを押してシンセサイザーに放射能の放出を確認します,望ましい放射能量に達した後(約120 GBqは30分後)。 全自動放射線合成の実行 システムが放射能を受信する準備ができていることを確認し、自動化されたプロセスを開始する 次の自動化プロセスを監視します。 [11C]CO2がV26(約4分)を介してサイクロトロンから合成ユニットに自動的に転送され、[11C]CO2が触媒としてニッケルを含浸させた分子篩に閉じ込められているかどうかを確認してください(11歳C]CO2トラップ)を室温で使用する。 [11C]CO2トラップが最初にヘリウム(50 mL·min-1)で自動的にフラッシュされ、次に水素ガス(120 mL·min-1)でフラッシュされた場合に追跡します。次に、V27とV25が閉じられ、水素ガスを含む[11C]CO2が400°Cに加熱され、形成された[11 C]CH4がさらに予冷冷却された[11 C]CH4に輸送されていることを観察します。 トラップし、そこに閉じ込められました。 V10が閉じているモニター、V9が開いた(ヨウ素柱に向かって)と[11 C]CH 4は[11 C]CH 4トラップを80°Cにゆっくりと加熱することによって再び解放され、ヘリウム流を介して循環ユニットに運ばれるV10(排気口)。さらに[11 C]CH4が循環部内で[11 C]CH3Iに変換され、約3分間続き、形成された[11 C]CH3 Iが[11C]に連続的に閉じ込められているかどうかをさらに確認します。CH3私はトラップします。 排気弁V16が開き、[11 C]CH3IトラップがV24を介してヘリウム(20 mL·min-1)の流れで90°Cに加熱されていることを確認してください。ここで、可能な副産物が除去され、V16が閉じられる。 [11C]CH3Iが原子炉に放出される準備ができていることを確認する。 次の自動化プロセスを監視する:[11 C]CH3Iトラップが190°Cに加熱され、形成された[11 C]CH3Iが[11 C]CH3OTfトラップ(V32およびV33、まだ200° ) を介して反応器に放出されているかどうかを確認します。C)、連続ヘリウム流下のV7、およびV8(10〜25 mL·min-1、V24)。このプロセス中に、V21 と V23 (排気出口) を開く必要があります。 原子炉内の放射能量がもう上がっていないと、原子炉に放射能が到着したことを確認します。 次の自動化プロセスを監視し、必要に応じて手動による介入の準備を行う V23、V21、V8が自動的に閉じられ、反応混合物が75°Cに加熱されているかどうかを確認します。3分後、温度が35°C以下になるまで液体窒素で反応器が冷却されているかどうかを観察します。その後、反応混合物がV2を介して水の1.5 mLで消水されていることを確認してください。このプロセス中に、V21 と V23 (排気出口) を開く必要があります。 V21とV23が閉じられ、反応混合物がHPLCループ(5 mL)に流体検出器を通過してHPLC注入弁に移されるかどうかを追跡します。反応混合物が自動的にHPLCカラムに注入されるかどうかを追跡します。 クロマトグラムを観察し、ボタンピークスタートを介して手動で製品のピークをカット.製品のピーク信号が約8-10分の保持時間の後に約400 cpsを下回ったときにピーク終了を押します(流れ:5 mL·分-1、図3)。 追加のヘリウムストリームをオンにして、電球の空を加速します。 電球が空いているかどうかを監視し、廃棄物ボトルを観察する:V11、SPEカートリッジ、V12を介して廃棄物に電球が空にされているかどうかを確認し、V19と追加のヘリウムラインを介してヘリウムラインを使用して廃棄物に、製品がSPEカートリッジに保持されているかどうかを確認します。 電球が完全に空であることを確認します。 SPE精製と製品転送の自動化プロセスの監視 SPEカートリッジがV6、V11、V12を介して10 mLの水で洗浄されているかどうか、エタノールがV5、V11、V12を介して製品をPCVに溶出するかどうかを確認します。最後に、製品を希釈するためにV4、V11、V12を介してPCVに0.9%のNaClが追加されているかどうかを観察します。 製品溶液がV13と無菌フィルターを介してV20経由でヘリウムストリームで最終製品バイアルに転送されることを確認してください。 製品が完全に転送されたことを確認します。 3. 品質管理(QC) 注:放射性医薬品の品質管理には、以下のパラメータの測定が含まれます。 放射化学的純度とモル活性(RP-HPLC) 残留溶媒(ガスクロマトグラフィー、GC) オスモラリティ(蒸気圧浸透計) pH (pH メーター) γスペクトル/放射性核種純度(γ分光計) 半減期/放射性核種純度(用量キャリブレーター) すべての物理化学パラメータは、製品のリリース前に決定され、値は定義された品質パラメータ範囲内である必要があります。 品質管理装置の準備 合成終了の30分前に調製を開始する。 リードシールド容器に円錐状のバイアルを準備し、付属の針でシールドされた1 mLシリンジを準備します。 HPLC用の水中SNAP-7941(10 μg·mL-1)の基準標準溶液を調製します。 pHメーター、ガスクロマトグラフ、使用ガス、浸透度計、HPLCのすべてのコンポーネントをオンにします。 HPLC制御ソフトウェアをオンにし、専用カラムと[11C]SNAP-7941のそれぞれの方法を選択します(移動相:(水/酢酸97.5/2.5 v/v;2.5 g.L-1酢酸アンモニウム;pH 3.5)/アセトニトリル70/30v;フロー:1mL-1)2つの測定値(標準および製品)を含むサンプルリストを書きます。列の条件付け方法を開始します。 10分のコンディショニング後にハミルトンシリンジでSNAP-7941リファレンス溶液の20 μLを注入し、分析実行を開始します。 注射後にアセトニトリルと水でハミルトン注射器を2回洗います。 GC 制御ソフトウェアを起動し、サンプル リストを作成します。 品質管理の実行 合成終了後の製品の絶対放射性収量を測定し、品質管理のために準備された鉛シールドシリンジを使用して反応バイアルに製品の100 μLを転送します。注:品質管理から取得したすべてのデータは、国の規制に従って文書化する必要があります。 分析HPLC:放射化学的純度と化学純度を測定し、その結果を直ちに細胞培養実験担当者に通知します。 QCサンプルの40 μLを引き出し、HPLCに注入します。インジェクションバルブのアームを負荷から注入に移動して実行を開始します (図3)。注:実行中(8分)、プロトコルの他の測定は、可能な限り多くの崩壊を避けるために行うことができます。 クロマトグラムを開き、放射能チャネルのすべてのピークを統合します。製品の保持時間(5.0~7.0分)とリファレンス規格の保持時間を比較します。すべての統合ピークのパーセントで曲線の下の面積を比較します。製品のピークは、全統合領域(無線チャンネル)の95%以上(放射化学純度)でなければなりません。 UVチャネルに信号を統合して、化学的純度を決定します。主な不純物は、通常、2.8〜3.5分の前駆体SNAP酸です。[natC]SNAP-7941の濃度は、積分後の較正曲線から算出される。μmol·mL-1でのSNAP-7941の濃度を計算し、次の式によってモル活性を決定します。 ガスクロマトグラフィーの場合は、専用ガラスバイアルに品質管理サンプルの20 μLを転送します。オートサンプラーに入れ、測定を開始します。測定が終了したら、クロマトグラムを開き、自動的に統合されたピークの数を書き留めます。サンプルには、410 ppm以上のアセトニトリルと10%エタノールを含んではならない。 オスモラリティ:専用の中空に紙サンプルディスクを置き、サンプルの10 μLを適用します。浸透度を測定するには、閉じるボタンを押します。3分後、デバイスは190-500 mosm·kg-1の範囲でなければならない浸透性を表示します。 pH: 電極を水で洗います。試料に電極を入れてpHを測定します。pH は 5.0 ~ 8.5 の範囲である必要があります。測定後に電極を再度洗浄し、基準pH溶液に電極を入れなさい。 γスペクトル:QCサンプルをγ分光計に入れ、制御ソフトウェアを開き、測定を開始します。測定を停止し、511 keV (範囲 420 – 520 keV) である必要がある測定されたエネルギーを書き留める.ファイルメニューを開き、それぞれのバッチ番号でファイルを安全にします。専用ソフトウェアで保存されたスペクトルを思い出し、スペクトルを印刷します。 半減期:用量キャリブレーターを使用して、QCサンプルの活性を2回測定します。それぞれの時間を書き留め、指数の半減期を計算します。 リリース すべてのパラメータがテストされ、結果がオーストリア当局のガイドラインに従っている後、放射光放射レーサーを解放します。演算子は、データの正確性に署名する必要があります。 4. P-gpトランスポーターに対する相互作用の評価 細胞培養 ワークベンチの層積層空気流(LAF)を開始し、作業を開始する前に少なくとも15分ベンチをきれいにします。 LAFの無菌条件下で細胞培養培地をFCS(50 mL)の10%、抗生物質の0.5%(2.5mL)と、自動ピペッティング補助を使用して無菌容積ピペットと混合します。 MDCKII-hMDR1およびMDCKII-WT細胞を解凍し、無菌条件(LAF)下での実験の10〜14日前にT75またはT175細胞培養フラスコで培養する。 翌日に培地を変更して、付着細胞やアポトーシス細胞をすべて除去します。 3日おきに培地を新鮮なもの(T75の場合は12mL、T175細胞培養フラスコでは23mL)に置き換える。 実験の時間スケジュールに従って細胞を新鮮なフラスコまたは細胞培養皿に80%の合流時に分割し、二重層の成長を避ける。 実験用細胞製剤 実験の2日前に細胞を分割し、細胞培養皿の斜め平面で2mL当たり2.5 x 105細胞の濃度で播種する(図4)。自動セルカウンター装置またはノイバウアー計数室を使用して、細胞をカウントし、適切な分割比を計算します。 実験の1日前に培地を取り出し、DPBSの4mLで培養皿上の細胞を洗浄し、新鮮な5mLの細胞培養培地を添加する。皿をインキュベーターに水平に置きます。 実験の前に少なくとも0.5hのDPBSで細胞を洗浄し、FBSフリー培地の2 mLで置き換えます。合流と細胞形態を顕微鏡で調べます。 3つの異なるセットアップで実験を行います。 4.2.3 で説明されているように、実験にはペトリ皿を使用します。 10 μM(±)-ベラパミル塩酸塩を用いた実験の前に0.5時間細胞を処理します。 ベラパミルストック溶液の0.98 μL(DMSOで20.4 mM(±)-ベラパミル塩酸塩)を追加します。最終的なDMSO含有量は、治療中に≤0.05%である。 車両制御(DMSO)で0.5時間セルをインキュベートします。薬物治療に使用されるのと同じボリュームを使用してください。 リアルタイムアッセイの実験(3つのセットアップすべてについて) デバイス、コンピュータの電源を入れ、正しく接続されていることを確認してから、制御ソフトウェアを開きます。 [1 つのターゲット]オプションを選択し、テンプレートのロックを解除し、次の設定を調整します。役職数: 2 (2)検出時間(秒):3(3)検出遅延時間 (2)最初のフェーズの名前: ベースライン 細胞培養皿を装置の傾斜支持部に挿入し、セルポールが底面にあり、細胞培養培地で覆っていることを確認する。 [スタート]ボタンから実行を開始します。システムがファイルの保存を要求しています。ファイル名と保存パスを選択します。コントロールセンターがポップアップし、ベースライン測定が開始されます(細胞培養皿サポートが回転し始めます)。 [その他のオプション]で選択します。時間スケール: 分核化物補正:カーボン-11 グラフ(背景(背景)、ターゲット(青)、ターゲットマイナス背景(黒)のカーブの下にあるすべてのボックスをチェックします。 品質管理パラメータを取得する:合成終了時のモル活性[GBq.μmol-1]および活性濃度[MBq.mL-1]。 2 mLのアッセイ容積で[natC]SNAP-7941の15 nMのそれぞれのトレーサー容積を計算する。 ピペットをそれぞれのボリュームに用意し、リードシールドで[11C]SNAP-7941製品のアリコートを用意します。 コントロール センター ウィンドウで[実行を一時停止]をクリックします。皿の回転が止まり、タイトルが一時停止して次のフェーズが発生するまで待ちます。 リアルタイムキネティックデバイスの蓋を開きます。カルチャーディッシュサポートを90°左に回します。計算されたトレーサーのボリュームを追加し、初期位置に戻します。次に、デバイスの蓋を閉じます。すぐに[続行]ボタンを押して実験を開始します。 一時停止を選択して 20 分後に実験を終了し、その後実行を終了します (サイド バーの[終了] を押します)。 統計ソフトウェアを用いてのデータ分析と処理 リアルタイム制御ソフトウェアを開きます。[ファイルを開く]をクリックして、必要な運動学を呼び出します。動態はコントロールセンターウィンドウに示されています。 キネティクスのエクスポート カーブを右クリックして選択します。生データを含むテキスト ファイルを保存します。統計プログラムを開き、リアルタイム実験の生データファイルを貼り付けます。 放射トレーサの追加時(x軸)から開始し(バックグラウンド測定を除く)、最大CPSのパーセント信号(毎秒カウント)に正規化します。 すべての正規化されたデータを新しい GraphPad プリズム ファイルに読み込みます。 平均値と標準偏差を計算します。 得られたデータを、3つのセットアップすべてのトレーサー取り込みの偏差(増加率)を示すグラフとして図示する。