Kültürde memeliler hücrelerinde Disulfide bağlantıları ile stabilize Multimeric kompleksleri algılamak için non-azaltma SDS-sayfa analizi ve kimyasal Crosslinking birleştiren
Summary
Disulfide bağlantıları uzun birçok proteinlerin yapısını stabilize olduğu bilinmektedir. Bu bağlantıyla stabilize edilmiş multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem, SDS-PAGE analizinin azaltılması yoluyla yapılır. Burada, bu yöntem, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS dutpase nükleer izoformu analiz ederek gösterilmektedir.
Abstract
Birçok proteinlerin yapıları, kovalent disülfür bağlantıyla stabilize edilir. Son zamanlarda bu bağ da bir post-translational modifikasyon olarak sınıflandırılmıştır. Böylece, bu değişiklik yaşam hücrelerinde çalışma muktedir önemlidir. Bu sistein-stabilize multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem olmayan SDS-sayfa analizi ve formaldehit çapraz bağlama iki adımlı bir yöntem aracılığıyla. Bu iki adımlı Yöntem, teknik kolaylığı ve düşük kullanım maliyeti nedeniyle disülfit bağlantıyla stabilize edilmiş multimerik kompleksleri açığa çıkarmak için ilk adım olarak avantajlıdır. Burada, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS özellikle dutpase nükleer izoformu analiz ederek bu yöntemi göstermek için kullanılır.
Introduction
Disulfide bağlantıları uzun birçok proteinlerin yapısını stabilize olduğu bilinmektedir. Son çalışmalar, bu Bond da geri dönüşümlü bir post-translational modifikasyon olarak sınıflandırılmıştır, bir sistein tabanlı olarak hareket “redox anahtarı” protein fonksiyonu modülasyonu için izin, konum ve etkileşim1,2, 3,4. Böylece, bu değişiklik çalışabilmesi önemlidir. Bu sistein-stabilize multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem olmayan azaltarak SDS-sayfa analizi5. SDS-page analizi, sonuçların hızlı, kolay ve minimal maliyetlerle elde edileceği ve yorumlandığı birçok laboratuvarlarda kullanılan bir tekniktir ve Mass spektrometri 6 gibi disülfit bağlantıları tanımlamak için kullanılan diğer teknikler üzerinde avantajlıdır. ,7 ve dairesel dikroizm8.
Bu yöntem bir çalışmada yardımcı olmak için uygun bir tekniği olup olmadığını belirlemede önemli bir adım iyice sistein kalıntı (ler) mevcut olması için faiz protein birincil sırasını incelemek için. Başka bir yararlı adım yayınlanan herhangi bir önceki kristal yapıları araştırma veya sistein kalıntı (ler) bulunabilir görselleştirmek için ilgi proteininin üç boyutlu yapısını keşfetmek için bir Biyoinformatik uygulama kullanın etmektir. Kalıntı (lar) dış yüzeyde varsa, yapının içinde gömülü bir sistein kalıntı yerine disülfür bağlantı oluşturmak için daha iyi bir aday olabilir. Ancak, proteinlerin substrat etkileşimleri veya protein-protein etkileşimleri üzerine yapısal değişiklikler geçirebilir ve bu kalıntıları daha sonra da çevreye maruz kalmalarına izin vermek önemlidir.
Tanımlanan multimerik kompleksleri daha sonra formaldehit kullanarak kimyasal çapraz bağlama ile doğrulanabilir. Formaldehit, yüksek hücreli geçirgenliği ve ~ 2-3 Å kısa çapraz bağlama aralığı nedeniyle bu doğrulama tekniği için ideal bir çapraz bağlayıcı, spesifik protein-protein etkileşimlerini tespiti sağlamak9,10. Burada, bu yöntem, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS11dutpase nükleer izoformu analiz ederek gösterilmiştir. Ancak, bu protokol diğer hücre hatları, dokular ve organizmalar için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada özetlenen Yöntem, disülfür bağlantıları aracılığıyla stabilize multimerik kompleksleri analizi için düz ileri bir protokol verir. Bu protokol, geniş bir uygulama yelpazesi için izin veren diğer hücre kültürü hatları, dokulara ve organizmalara kolayca adapte edilebilir.
Bu prosedürün önemli bir adımı disülfit bağlantıların ekstraksiyon prosedürün bir sonucu olmadığından emin olmaktır. Herhangi bir ücretsiz sistein kalıntıları iodoacetamid<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu taslağı düzenlemeye yardımcı olmak için tüm çabalarını dutpase poliklonal antikor ve Kerri ciccaglione arıtma için Dr Jennifer Fischer tarafından ileriye koymak çabaları minnettarız. Bu araştırma kısmen New Jersey Sağlık Vakfı (Grant #PC 11-18) bir hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
References
- Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
- Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).
- Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins. Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).
- Groitl, B., Jakob, U. Thiol-based redox switches. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).
- Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha. Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).
- Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. Protein disulfide bond determination by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).
- Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).
- Kelly, S. M., Price, N. C. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585 (2010).
- Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).
- Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut). Protein Science. , (2018).
- Caradonna, S., Muller-Weeks, S. The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity. Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).
- Macpherson, L. J., et al. Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines. Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).
