שילוב מערכות SDS ללא הפחתה-דף ניתוח ויצירת קישור כימי כדי לזהות מכלולי מולטימאריק התייצב על ידי הקשרים הדיסולריים בתאי היונקים בתרבות
Summary
הקשרים disulfide כבר זמן רב ידועים לייצב את המבנה של חלבונים רבים. שיטה פשוטה לנתח מכלולי מולטימאריק התייצב על ידי קישורים אלה היא באמצעות ניתוח שאינו מקטין SDS-PAGE. כאן, שיטה זו מומחש על ידי ניתוח isoform גרעינית של דאפס של העצם האנושית קו התאים אוסטאוסרקומה U-2 מערכת ההפעלה.
Abstract
המבנים של חלבונים רבים מיוצבים באמצעות קישורים דיצינטיים בעלי מבנה קוולנטי. בעבודה האחרונה, הקשר הזה מסווג גם כשינוי פוסט-טרנסלייתי. לכן, חשוב להיות מסוגל ללמוד שינוי זה בתאי החיים. שיטה פשוטה לנתח אלה cysteine התייצב מכלולי מערכות הוא באמצעות שיטת שני שלבים של שאינם מצמצמים SDS-ניתוח דף ו פורמלדהיד המקשר החוצה. זו שיטה בשני השלבים הוא יתרון כמו הצעד הראשון כדי לחשוף מכלולי מולטימאריק התייצב על ידי הקשרים קשר דיסולפידי בגלל הקלות הטכנית שלה עלות נמוכה של המבצע. כאן, העצם האנושית של קו התאים מערכת ההפעלה U-2 משמש כדי להמחיש שיטה זו על ידי ניתוח במיוחד של isopase גרעינית של דאפס.
Introduction
הקשרים disulfide כבר זמן רב ידועים לייצב את המבנה של חלבונים רבים. בעבודה האחרונה, הקשר הזה מסווג גם כשינוי הפיך לאחר המעבר, מתנהג כמו מיתוג מבוסס cysteine “המאפשר אפנון של פונקציית חלבון, מיקום ואינטראקציה1,2, 3,4. לכן, חשוב להיות מסוגל ללמוד את השינוי הזה. שיטה פשוטה לנתח אלה cysteine התייצב מכלולי מערכות הוא דרך שאינם מצמצמים SDS-ניתוח עמוד5. Sds-ניתוח העמוד הוא טכניקה המשמשת במעבדות רבות, שבו ניתן להשיג את התוצאות ולפרש במהירות, בקלות, עם עלויות מינימליות, והוא יתרון על טכניקות אחרות המשמשות לזיהוי הקשרים קשר דיסולפידי כגון ספקטרומטר המוני6 ,7 ו קיווטות מעגלית8.
צעד חשוב אחד לקבוע אם שיטה זו היא טכניקה מתאימה כדי לסייע במחקר היא לבחון ביסודיות את הרצף העיקרי של חלבון הריבית כדי להבטיח שיש שאריות ציסטאין (s) נוכח. צעד מועיל נוסף הוא לחקור כל מבנה גביש הקודם שפורסם או להשתמש באפליקציה בביואינפורמטיקה כדי לחקור את המבנה תלת מימדי של חלבון הריבית כדי לדמיין היכן שאריות ציסטאין (s) יכול להיות ממוקם. אם השאריות נמצאות על המשטח החיצוני, היא עשויה להיות מועמדת טובה יותר ליצירת הצמדה דיגואנית במקום שאריות ציסטאין הקבורים בתוך המבנה. עם זאת, חשוב לציין כי חלבונים עשויים לעבור שינויים מבניים על אינטראקציות המצע או האינטראקציות חלבון חלבון המאפשר שאריות אלה להיות חשופים גם לסביבה.
זיהה מכלולי מולטימאריק יכול להיות מאומת עם החוצה קישור כימי באמצעות פורמלדהיד. פורמלדהיד הוא האידיאלי cross-מקשר עבור טכניקת אימות זה בשל חדירות התא גבוה החוצה טווח קישור קצר של ~ 2-3 Å, להבטיח זיהוי של אינטראקציות חלבון חלבונים ספציפיים9,10. כאן, שיטה זו מומחש על ידי ניתוח isoform גרעינית של דאפס של העצם האנושי מערכת התאים אוסטאוסרקומה U-2 OS11. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור קווי תאים אחרים, רקמות ואורגניזמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארים כאן מעניקה פרוטוקול ישר קדימה לניתוח של מכלולי מולטימאריק התייצב באמצעות קישור דיגופרתי. פרוטוקול זה ניתן בקלות להתאים קווים אחרים תרבות התא, רקמות ואורגניזמים המאפשרים מגוון רחב של יישומים.
צעד חשוב בהליך זה הוא להבטיח את הקישור הדיגופרתי הגילאים אינם תוצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מעריכים בהכרת תודה את המאמצים המפורטים על ידי ד ר ג’ניפר פישר לטיהור הנוגדן של דפאטה פוליבטיים ו Kerri Ciccaglione עבור כל מאמציה לעזור לערוך את כתב היד. מחקר זה היה נתמך באופן חלקי על ידי מענק מקרן ניו ג’רזי בריאות (גרנטPC 11-18).
Materials
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
References
- Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
- Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).
- Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins. Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).
- Groitl, B., Jakob, U. Thiol-based redox switches. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).
- Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha. Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).
- Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. Protein disulfide bond determination by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).
- Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).
- Kelly, S. M., Price, N. C. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585 (2010).
- Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).
- Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut). Protein Science. , (2018).
- Caradonna, S., Muller-Weeks, S. The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity. Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).
- Macpherson, L. J., et al. Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines. Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).
