Combinando analisi SDS-PAGE non riducenti e reticolazione chimica per rilevare complessi multimerici stabilizzati dai legami disolfuro nelle cellule di mammiferi nella cultura

I legami disolfuro sono stati a lungo conosciuti per stabilizzare la struttura di molte proteine. Nel recente lavoro, questo legame è stato anche classificato come una modifica post-traslazionale reversibile, agendo come un “interruttore redox” a base di cisteina che consente la modulazione della funzione proteica, la posizione e l’interazione^{1,2, 3,4}. Pertanto, è importante essere in grado di studiare questa modifica. Un metodo semplice per analizzare questi complessi multimerici stabilizzati con cisteina è attraverso l’analisi non-riduzione SDS-PAGE⁵. L’analisi SDS-PAGE è una tecnica utilizzata in molti laboratori, dove i risultati possono essere ottenuti e interpretati in modo rapido, semplice e con costi minimi, ed è vantaggioso rispetto ad altre tecniche utilizzate per identificare i legami disolfuro come la spettrometria di massa^{6 ,7} e dicroismo circolare⁸.

Un passo importante nel determinare se questo metodo è una tecnica appropriata per aiutare in uno studio è quello di esaminare accuratamente la sequenza primaria della proteina di interesse per assicurare che ci sono residui di cisteina (s) presenti. Un altro passo utile è quello di ricercare le precedenti strutture cristalline pubblicate o utilizzare un’applicazione bioinformatica per esplorare la struttura tridimensionale della proteina di interesse per visualizzare dove possono essere localizzati i residui di cisteina. Se il residuo (s) è presente sulla superficie esterna può essere un candidato migliore per formare un legame disolfuro piuttosto che un residuo di cisteina sepolto all’interno della struttura. Tuttavia, è importante notare che le proteine possono subire cambiamenti strutturali sulle interazioni del substrato o sulle interazioni proteina-proteina permettendo che questi residui diventino poi esposti anche all’ambiente.

I complessi multimerici identificati possono quindi essere verificati con il cross-linking chimico usando la formaldeide. La formaldeide è un cross-linker ideale per questa tecnica di verifica a causa dell’elevata permeabilità alle cellule e della breve estensione di ~ 2-3 Å, assicurando il rilevamento di interazioni proteina-proteina specifiche^9,10. Qui, questo metodo è illustrato analizzando l’isoforma nucleare di dUTPase dalla linea cellulare osteosarcoma ossea umana U-2 OS¹¹. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per altre linee cellulari, tessuti e organismi.