الجمع بين تحليل الصفحات غير المتناقصة والربط الكيميائي للكشف عن مجمعات مولتيميرك التي استقرت بالروابط الثنائية في خلايا الثدييات في الثقافة
Summary
ومنذ فتره طويلة من المعروف ان الروابط الثنائية الكبريتيد لتحقيق الاستقرار في هيكل العديد من البروتينات. والطريقة البسيطة لتحليل المجمعات التي استقرت فيها هذه الروابط هي من خلال عدم الحد من البيانات التحليلية للصفحات. هنا ، يتم توضيح هذه الطريقة عن طريق تحليل ايزوفورم النووية من دوبيز من العظم البشري خط الخلايا العظمية U-2 OS.
Abstract
وتستقر هياكل العديد من البروتينات من خلال الروابط الثنائية التكافؤ. وفي الاعمال الاخيره ، صنفت هذه الرابطة أيضا علي انها تعديل بعد الإجراءات الانتقالية. التالي ، من المهم ان تكون قادره علي دراسة هذا التعديل في الخلايا الحية. طريقه بسيطه لتحليل هذه المجمعات مولتيمريك استقرت السيستين هو من خلال طريقه من خطوتين من عدم الحد من SDS-صفحه التحليل و الفورمالديهايد عبر ربط. هذه الطريقة من خطوتين هو مفيد كخطوه اولي للكشف عن المجمعات مولتيمريك استقرت من خلال الروابط الثنائية بسبب سهوله التقنية وانخفاض تكلفه التشغيل. هنا ، يستخدم العظم البشري خط الخلايا العظمية U-2 OS لتوضيح هذه الطريقة عن طريق تحليل علي وجه التحديد ايزوفورم النووية من دوبيز.
Introduction
ومنذ فتره طويلة من المعروف ان الروابط الثنائية الكبريتيد لتحقيق الاستقرار في هيكل العديد من البروتينات. في العمل الأخير ، وقد صنفت هذه الرابطة أيضا كتعديل عكسها بعد الانتقالية ، بوصفها المستندة إلى السيستين “تبديل الاكسده” السماح لتحوير وظيفة البروتين ، والموقع والتفاعل1،2، 3,4. التالي ، من المهم ان تكون قادره علي دراسة هذا التعديل. طريقه بسيطه لتحليل هذه المجمعات مولتيمريك استقرت السيستين من خلال عدم الحد من SDS-تحليل الصفحة5. تحليل SDS-PAGE هو أسلوب يستخدم في العديد من المختبرات ، حيث يمكن الحصول علي النتائج وتفسيرها بسرعة وسهوله وباقل التكاليف ، وهو مفيد علي التقنيات الأخرى المستخدمة لتحديد الروابط الثنائية الكبريتيد مثل قياس الطيف الكتلي6 ,7 و [ديشرويسم] دائريه8.
خطوه هامه واحده في تحديد ما إذا كان هذا الأسلوب هو تقنيه مناسبه للمساعدة في الدراسة هو فحص دقيق للتسلسل الأساسي للبروتين الفائدة لضمان وجود بقايا السيستين (ق) الحالية. خطوه أخرى مفيده هي البحث عن اي هياكل الكريستال السابقة التي نشرت أو استخدام تطبيق المعلوماتية الحيوية لاستكشاف بنيه الابعاد الثلاثة للبروتين من الفائدة لتصور حيث بقايا السيستين (ق) قد تكون موجودة. إذا كانت بقايا (ق) موجودة علي السطح الخارجي قد يكون أفضل مرشح لتشكيل الربط الكبريتيد بدلا من بقايا السيستين مدفونة في الداخل من الهيكل. ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان البروتينات قد تخضع للتغيرات الهيكلية علي التفاعلات الركيزة أو تفاعلات البروتين البروتين السماح لهذه المخلفات لتصبح ثم تتعرض للبيئة ، وكذلك.
يمكن بعد ذلك التحقق من المجمعات مولتيمريك المحددة مع الكيميائية عبر ربط استخدام الفورمالديهايد. الفورمالديهايد هو مثاليه عبر رابط لهذه التقنية التحقق بسبب نفاذيه الخلية العالية وقصيرة عبر ربط تمتد من ~ 2-3 Å ، وضمان الكشف عن التفاعلات بروتين البروتين محدده9،10. هنا ، يتم توضيح هذه الطريقة عن طريق تحليل ايزوفورم النووية من دوبيز من العظم البشري خط الخلايا العظمية U-2 OS11. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لخطوط الخلايا الأخرى والانسجه والكائنات الحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
والطريقة المبينة هنا تعطي بروتوكولا مستقيما لتحليل المجمعات المعقدة التي استقرت من خلال الروابط الثنائية الكبريتيد. ويمكن بسهوله تكييف هذا البروتوكول مع غيرها من خطوط ثقافة الخلايا والانسجه والكائنات الحية مما يسمح لطائفه واسعه من التطبيقات.
ومن الخطوات الهامه في هذا ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نقدر بامتنان الجهود التي بذلتها الدكتورة جنيفر فيشر لتنقيه الأجسام المضادة المتعددة الأضلاع دوبيز و Kerri سيككاجليوني لجميع جهودها للمساعدة في تحرير هذه المخطوطة. وقد دعم هذا البحث جزئيا بمنحه من مؤسسه نيو جيرسي الصحية (منحه #PC 11-18).
Materials
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
References
- Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
- Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).
- Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins. Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).
- Groitl, B., Jakob, U. Thiol-based redox switches. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).
- Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha. Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).
- Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. Protein disulfide bond determination by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).
- Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).
- Kelly, S. M., Price, N. C. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585 (2010).
- Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).
- Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut). Protein Science. , (2018).
- Caradonna, S., Muller-Weeks, S. The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity. Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).
- Macpherson, L. J., et al. Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines. Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).
