Pomalidomür tabanlı homo-PROTACs tarafından E3 Ubiquitin ligase Cereblon kimyasal Inaktivasyonu
Summary
Bu çalışma, bir pomalidomür bazlı sentez ve karakterizasyon açıklar, yeni bir yaklaşım olarak bir roman yaklaşımı ve E3 Ubiquitin ligaz cereblon (CRBN), thalidomür analogların hedefi bozulması teşvik etmek.
Abstract
İmmünomodülatör ilaçlar (imids) thalidomür ve onun analogları, lenalidomür ve pomalidomür, multipl Myeloma tedavisi için tüm FDA onaylı ilaçlar, ikaros (IKZF1) ve Aiolos lenfoid transkripsiyon faktörlerinin mayası ve bozulma neden (IKZF3) proteasomal bozulma için cereblon (CRBN) E3 Ubiquitin ligaz üzerinden. İmids yakın zamanda Chimeras (protacs) hedefleyen bifonksiyonel proteoliz nesil için kullanılan edilmiştir crbn E3 ligaz tarafından mayası ve proteasomal bozulması için diğer proteinlerin hedef. Biz tasarlanan ve sentezlenmiş pomalidomür tabanlı homobifunctional protacs ve kendi kendini yönettiği mayası ve crbn bozulması teşvik yeteneğini analiz. Burada, CRBN hem E3 Ubiquitin ligaz hem de hedef aynı anda hizmet vermektedir. Homo-PROTAC bileşik 8 IKZF1 ve IKZF3 üzerinde sadece minimal kalan etkileri ile yüksek bir potens ile crbn düşer. Bileşik 8 tarafından crbn inaktivasyonu hücre canlılığı ve farklı Multipl myelom hücre hatları proliferasyon üzerinde hiçbir etkisi yoktu. Bu homo-Protac multipl miyelom hücrelerinde imids etkilerini CPAP. Bu nedenle, bizim homodimeric pomalidomür bazlı bileşikler CRBN ‘s endojen substratlar ve fizyolojik fonksiyonları belirlemek ve IMiDs moleküler mekanizmasını araştırmak için yardımcı olabilir.
Introduction
İmmünomodülatör ilaçlar (IMiDs) thalidomür ve onun analogları, lenalidomür ve pomalidomür, multipl Myeloma tedavisi için onaylanmış, E3 Ubiquitin ligaz cereblon (CRBN) bind, cullin4A-RING E3 Ubiquitin ligaz için bir substrat adaptörü (CRL4crbn)1,2,3. İmids bağlayıcı CRL4crbn lenfoid transkripsiyon faktörleri ikaros (IKZF1) ve Aiolos (IKZF3), kendi mayası ve bozulma yol açan benzeşimi geliştirir (Şekil 1)4,5, 6 , 7 , 8. bu yana IKZF1 ve IKZF3 multipl miyelom hücreleri için gerekli olan, büyüme inhibisyonu onların inaktivasyon sonuçları. SALL4 son zamanlarda, thalidomür9,10neden 1950 ‘ lerde teratogenisite ve sözde Contergan felaketinden sorumlu büyük olasılıkla crbn ek bir İmid kaynaklı Neo-substrat olarak bulundu. Buna karşılık, kasein kinaz 1α (CK1α), kromozom 5q silme11ile myelodisplastik sendromunda terapötik etkiye BULAŞMıŞ crbn lenalidomür spesifik bir substrat.
Küçük moleküllerin bozulma için spesifik bir protein hedeflemesini yeteneği modern ilaç gelişimi için heyecan verici bir ima. Thalidomür ve onun analogları mekanizması insanlarda ilk kullanımından sonra keşfedilen iken, bu nedenle PRoteolysis targeting Chimeras (protacs) olarak adlandırılan özellikle bir faiz (POI) bir protein hedef için tasarlanmıştır (Şekil 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs, crbn veya von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20gibi bir E3 Ubiquitin ligaz bir ligand için bir bağlayıcı ile bağlı POI için belirli bir ligand oluşur heterobifetertional moleküller 21,22. Protacs bir geçici Üçlü Kompleks oluşumunu teşvik, E3 Ubiquitin ligaz için POI yönlendirmek, onun mayası ve proteasomal bozulması sonuçlanan. PROTACs konvansiyonel inhibitörler üzerinde önemli avantajları bir POı için bağlayıcı yerine onun inhibisyonu daha yeterli olduğunu ve bu nedenle PROTACs potansiyel olarak kabul edildi gibi proteinlerin çok daha geniş bir spektrum hedef olabilir böyle undruggable olarak transkripsiyon faktörleri15. Buna ek olarak, chimerik molekülleri katalytically hareket ve bu nedenle yüksek bir potens var. İÇN ‘ye Ubiquitin transferinden sonra, Üçlü Kompleks ayrışıp ve yeni kompleksleri oluşumu için kullanılabilir. Böylece, çok düşük PROTAC konsantrasyonları hedef protein23bozulması için yeterlidir.
Burada bir pomalidomür-pomalidomür konjuge homo-Protac sentezini açıklamak (bileşik 8) kendini bozulması için crbn acemi24. E3 Ubiquitin ligaz CRBN aynı zamanda hem işveren hem de hedef olarak hizmet vermektedir (Şekil 3). Verilerimizi doğrulamak için, aynı zamanda negatif bağlama kontrolü sentezlenmiş (bileşik 9). Verilerimiz yeni sentezlenmiş homo PROTAC ‘ın CRBN bozulması için spesifik olduğunu ve diğer proteinlerde sadece minimal etkilere sahip olduğunu teyit ediyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRBN için burada açıklanan gibi homo-PROTACs tasarımı CRBN için pomalidomür spesifik benzeşimi dayanır, hangi başarıyla sayısız heterobifunktional PROTACs kullanılmıştır ve PROTAC gelişimi sonuçlandı 8 bir yüksek olarak Seçici CRBN düşürücü. Molekülün özgüllüğü zaten proteomik analizlerle onaylandı24. Genetik aracılı nakavt için, yan etkilerin dışlama ve doğrulanması zorlu ve zaman alıcı bir işlemdir. Buna ek olarak, kimyasal kaynaklı …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından destekleniyordu (Emmy-Noether programı KR-3886/2-1 ve SFB-1074-J.K.; FOR2372)
Materials
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
References
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
- Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
- Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
- Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
- Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
- Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
- Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
- Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
- Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
- Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
- Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
- Schneekloth, J. S., et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
- Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
- Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
- Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
- Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
- Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
- Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
- Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
- Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
- Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
- Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
- Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
- Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
- Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
- Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
- Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
- Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
- Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
- Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).
