Chemische inactivatie van de E3 Ubiquitin ligase Cereblon door Pomalidomide-based homo-PROTACs
Summary
Dit werk beschrijft de synthese en karakterisering van een op pomalidomide gebaseerde, bifunctionele homo-PROTAC als een nieuwe benadering voor het induceren van alomtegenwoordige en afbraak van de E3 ubiquitine ligase cereblon (CRBN), het doelwit van thalidomide analogen.
Abstract
De immunomodulerende geneesmiddelen (IMiDs) thalidomide en zijn analogen, lenalidomide en pomalidomide, alle door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen voor de behandeling van multipel myeloom, induceren alomtegenwoordig en afbraak van de lymfoïde transcriptiefactoren Ikaros (IKZF1) en Aiolos (IKZF3) via de cereblon (CRBN) E3 ubiquitine ligase voor proteasomale afbraak. IMiDs zijn recentelijk gebruikt voor het genereren van bifunctionele proteolyse gericht op chimeras (Protac’s) om andere eiwitten op te richten voor alomtegenwoordige en proteasomale afbraak door de CRBN E3 ligase. We ontwierpen en synthetiseerden homobifunctionele Protac’s op basis van pomalidomide en analyseerden hun vermogen om zelfgeleide alomtegenwoordige en afbraak van CRBN te induceren. Hier fungeert CRBN als beide, de E3 ubiquitine ligase en het doelwit op hetzelfde moment. De homo-PROTAC compound 8 DEGRADEERT crbn met een hoge potentie met slechts minimale resterende effecten op IKZF1 en IKZF3. CRBN inactivatie door compound 8 had geen effect op de levensvatbaarheid van de cel en de proliferatie van verschillende multipel myeloom cellijnen. Deze homo-PROTAC abrogates de effecten van IMiDs in multipel myeloomcellen. Daarom kunnen onze homodimere pomalidomide-gebaseerde verbindingen helpen om de endogene substraten en fysiologische functies van CRBN te identificeren en het moleculaire mechanisme van IMiDs te onderzoeken.
Introduction
De immunomodulerende geneesmiddelen (IMiDs) thalidomide en zijn analogen, lenalidomide en pomalidomide, allemaal goedgekeurd voor de behandeling van multipel myeloom, binden aan de E3 ubiquitine ligase cereblon (CRBN), een substraat adapter voor cullin4A-RING E3 ubiquitine ligase (CRL4crbn)1,2,3. Binding van imids verbetert de affiniteit van CRL4crbn voor de lymfoïde transcriptiefactoren Ikaros (IKZF1) en Aiolos (IKZF3), leidend tot hun alomtegenwoordige en afbraak (Figuur 1)4,5, 6 , 7 , 8. Aangezien IKZF1 en IKZF3 essentieel zijn voor multipel myeloomcellen, resulteert hun inactivatie in groeiremming. SALL4 werd onlangs gevonden als een extra imid-geïnduceerde Neo-substraat van crbn die waarschijnlijk verantwoordelijk is voor de teratogeniciteit en de zogenaamde contergan catastrofe in de jaren 1950 veroorzaakt door thalidomide9,10. Caseïne kinase 1α (CK1α) is daarentegen een lenalidomide-specifiek substraat van CRBN dat betrokken is bij het therapeutische effect in myelodysplastisch syndroom met chromosoom 5q deleties11.
Het vermogen van kleine moleculen om een specifiek eiwit voor afbraak te targeten, is een spannende implicatie voor de moderne Geneesmiddelenontwikkeling. Hoewel het mechanisme van thalidomide en zijn analogen werd ontdekt na hun eerste gebruik bij de mens, werden zogenaamde PRoteolyse targeting Chimeras (protac’s) ontworpen om specifiek te richten op een eiwit van belang (POI) (figuur 2)12,13,14,15,16,17,18. Protac’s zijn heterobifunctionele moleculen die bestaan uit een specifieke ligand voor de POI verbonden via een linker aan een ligand van een E3 ubiquitine ligase zoals crbn of von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Protacs induceren de vorming van een voorbijgaande ternaire complex, dat de POI naar de E3 ubiquitine ligase leidt, resulterend in de alomtegenwoordige en proteasomale afbraak. De belangrijkste voordelen van Protac’s ten opzichte van conventionele remmers is dat de binding aan een POI voldoende is in plaats van de remming ervan en daarom kunnen Protac’s zich mogelijk richten op een veel breder spectrum van eiwitten, waaronder die welke als niet-Versleep baar werden beschouwd, zoals transcriptiefactoren15. Bovendien, chimerische moleculen handelen katalytisch en hebben daarom een hoge potentie. Na ubiquitine Transfer naar de POI, de ternaire complex dissocieert en is beschikbaar voor de vorming van nieuwe complexen. Zo zijn zeer lage PROTAC concentraties voldoende voor de afbraak van het doelwit eiwit23.
Hier beschrijven we de synthese van een geconjugeerde homo-PROTAC (compound 8) van pomalidomide-pomalidomide, die crbn aanwervent voor de afbraak van zichzelf24. De E3 ubiquitine ligase CRBN fungeert als zowel de recruiter en het doelwit op hetzelfde moment (Figuur 3). Om onze gegevens te valideren, hebben we ook een negatieve binding Control gesynthetiseerd (compound 9). Onze gegevens bevestigen dat de nieuw gesynthetiseerde homo-PROTAC specifiek is voor CRBN-degradatie en slechts minimale effecten heeft op andere eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het ontwerp van dergelijke homo-Protac’s zoals hier beschreven voor CRBN is gebaseerd op de specifieke affiniteit van pomalidomide aan CRBN, die met succes is gebruikt in talrijke heterobifunctionele Protac’s en resulteerde in de ontwikkeling van PROTAC 8 als een zeer selectieve CRBN-Degrader. De specificiteit van ons molecuul is al bevestigd door Proteomic analysen24. Voor genetisch gemedieerde knock-out, uitsluiting en validatie van bijwerkingen is uitdagend en tijdrovend. Boven…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether programma KR-3886/2-1 en SFB-1074 tot J.K.; FOR2372 naar M.G.)
Materials
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
References
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
- Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
- Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
- Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
- Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
- Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
- Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
- Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
- Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
- Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
- Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
- Schneekloth, J. S., et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
- Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
- Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
- Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
- Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
- Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
- Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
- Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
- Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
- Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
- Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
- Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
- Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
- Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
- Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
- Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
- Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
- Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
- Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).
