Chemische Inaktivierung des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon durch Pomalidomid-basierte Homo-PROTACs
Summary
Diese Arbeit beschreibt die Synthese und Charakterisierung eines pomalidomidbasierten, bifunktionellen Homo-PROTAC als einen neuartigen Ansatz zur Induzieren von Ubiquitination und Abbau des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon (CRBN), dem Ziel von Thalidomid-Analogen.
Abstract
Die immunmodulatorischen Medikamente (IMiDs) Thalidomid und seine Analoga, Lenalidomid und Pomalidomid, alle von der FDA zugelassenen Medikamente zur Behandlung von multiplem Myelom, induzieren Die Ubiquitination und den Abbau der lymphoiden Transkriptionsfaktoren Ikaros (IKZF1) und Aiolos (IKZF3) über den Cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ligase für den proteasomalen Abbau. IMiDs wurden vor kurzem für die Erzeugung von bifunktionaler Proteolyse verwendet, die auf Chimären (PROTACs) abzielt, um andere Proteine zur Ubiquitination und proteasomalen Degradation durch die CRBN E3 Ligase zu zielen. Wir haben pomalidomidbasierte homobifunktionelle PROTACs entwickelt und synthetisiert und ihre Fähigkeit analysiert, eine selbstgesteuerte Ubiquitination und Abbau von CRBN zu induzieren. Hier dient CRBN als beides, die E3-Ubiquitinligase und das Ziel zugleich. Die homo-PROTAC Verbindung 8 degradiert CRBN mit einer hohen Potenz mit nur minimalen verbleibenden Effekten auf IKZF1 und IKZF3. Die CRBN-Inaktivierung durch Verbindung 8 hatte keinen Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit und proliferation verschiedener multipler Myelom-Zelllinien. Dieser Homo-PROTAC hebt die Wirkung von IMiDs in mehreren Myelomzellen auf. Daher können unsere homodimeren Pomalidomid-basierten Verbindungen helfen, die endogene Substrate und physiologischen Funktionen von CRBN zu identifizieren und den molekularen Mechanismus von IMiDs zu untersuchen.
Introduction
Die immunmodulatorischen Medikamente (IMiDs) Thalidomid und seine Analoga, Lenalidomid und Pomalidomid, alle für die Behandlung von multiplem Myelom zugelassen, binden an die E3 Ubiquitin Ligase Cereblon (CRBN), ein Substratadapter für cullin4A-RING E3 Ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. Die Bindung von IMiDs erhöht die Affinität von CRL4CRBN zu den lymphoiden Transkriptionsfaktoren Ikaros (IKZF1) und Aiolos (IKZF3), was zu ihrer Ubiquitination und Degradation führt (Abbildung 1)4,5, 6 , 7 , 8. Da IKZF1 und IKZF3 für mehrere Myelomzellen unerlässlich sind, führt ihre Inaktivierung zu einer Wachstumshemmung. SALL4 wurde vor kurzem als zusätzliches IMiD-induziertes Neosubstrat von CRBN gefunden, das wahrscheinlich für die Teratogenität und die sogenannte Contergan-Katastrophe in den 1950er Jahren verantwortlich ist, die durch Thalidomid9,10verursacht wurde. Im Gegensatz dazu ist Caseinkinase 1 (CK1) ein Lenalidomid-spezifisches Substrat von CRBN, das in die therapeutische Wirkung beim myelodysplastischen Syndrom mit Chromosom 5q Deletionen11verwickelt ist.
Die Fähigkeit von Kleinmolekülen, ein bestimmtes Protein für den Abbau zu zielen, ist eine spannende Implikation für die moderne Arzneimittelentwicklung. Während der Mechanismus von Thalidomid und seinen Analoga nach ihrer ersten Anwendung beim Menschen entdeckt wurde, wurden so genannte Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) speziell für ein Protein von Interesse (POI) entwickelt (Abbildung 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs sind heterobifunktionelle Moleküle, die aus einem spezifischen Liganden für den POI bestehen, der über einen Linker mit einem Liganden einer E3-Ubiquitinligase wie CRBN oder von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20verbunden ist. 21,22. PROTACs induzieren die Bildung eines transienten ternären Komplexes, der das POI auf die E3-Ubiquitinligase lenkt, was zu seiner Ubiquitination und proteasomalen Degradierung führt. Der Hauptvorteil von PROTACs gegenüber herkömmlichen Inhibitoren besteht darin, dass die Bindung an ein POI ausreichend ist und nicht seine Hemmung, und daher können PROTACs potenziell auf ein weit breiteres Spektrum von Proteinen abzielen, einschließlich derer, die als undruggable wie Transkriptionsfaktoren15. Darüber hinaus wirken chimäre Moleküle katalytisch und haben daher eine hohe Potenz. Nach der Ubiquitin-Übertragung in die POI löst sich der ternäre Komplex und steht für die Bildung neuer Komplexe zur Verfügung. Somit reichen sehr niedrige PROTAC-Konzentrationen für den Abbau des Zielproteins23aus.
Hier beschreiben wir die Synthese eines Pomalidomid-Pomalidomid konjugierten homo-PROTAC (Verbindung 8), das CRBN für die Degradierung von sich selbst rekrutiert24. Die E3 ubiquitin ligase CRBN dient sowohl als Recruiter als auch als Ziel zugleich (Abbildung 3). Um unsere Daten zu validieren, synthetisierten wir auch eine negative Bindungskontrolle (Verbindung 9). Unsere Daten bestätigen, dass der neu synthetisierte Homo-PROTAC spezifisch für den CRBN-Abbau ist und nur minimale Auswirkungen auf andere Proteine hat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Design solcher homo-PROTACs, wie hier für CRBN beschrieben, beruht auf der spezifischen Affinität von Pomalidomid zu CRBN, die in zahlreichen heterobifunktionellen PROTACs erfolgreich eingesetzt wurde und zur Entwicklung von PROTAC 8 als hochgradig selektiven CRBN-Degrader. Die Spezifität unseres Moleküls wurde bereits durch proteomische Analysen bestätigt24. Für genetisch vermittelten Knockout ist der Ausschluss und die Validierung von Nebenwirkungen eine Herausforderun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 und SFB-1074 to J.K.; FOR2372 zu M.G.)
Materials
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
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