Измерение конкретных микобактериальных неправильных переводов с функцией усиления функции репортер системы
Summary
В этой статье мы представляем два взаимодополняющих метода для измерения конкретных темпов поступательного ошибки и неправильного перевода в модели микобактерии, микобактерии смегаматис, используя усиления функции репортер системы. Эти методы можно использовать для измерения точных коэффициентов ошибок при низкой пропускной способности или относительных показателях ошибок в более высокой пропускной способности.
Abstract
Перевод генов в белки подвержен ошибкам. Хотя средняя скорость поступательного ошибка в модельных системах оценивается в 1/10000 за Codon, фактические частоты ошибок сильно различаются, в зависимости от вида, окружающей среды и кодонов изучается. Ранее мы показали, что микобактерии используют двухступенчатый путь для генерации аминоацилилированного глютамина и акогадина tRNAs и что это конкретно связано с относительно высокими показателями ошибок из-за модуляции коэффициентов перевода важным компонентом пути, амидотрансферазы Гаткэб. Мы модифицировали ранее использоварованную систему двойного люциферазы Ренилла-Светлячок, которая использовалась для измерения количества неправильных переводов в кишечной палочки для использования в микобактериях для измерения специфических неправильных коэффициентов глутамата при глютамином кодонов и аспартат для акодонов. Хотя эта система репортер была подходящей для точной оценки конкретных ошибок, отсутствие чувствительности и требования к чрезмерной манипуляции шаги сделали его непригодным для высокой пропускной способностью приложений. Таким образом, мы разработали вторую систему усиления функции репортер, используя Nluc люциферазы и зеленого флуоресцентного белка (GFP), который более поддается средней/высокой пропускной способностью параметров. Мы использовали эту систему для идентификации касугамицина как небольшой молекулы, которая может уменьшить Микобактериальный неправильный перевод. Хотя журналисты, которые мы описываем здесь, были использованы для измерения конкретных типов микобактериального неправильного перевода, они могут быть изменены для измерения других типов неправильного перевода в ряде модельных систем.
Introduction
Поток информации в молекулярной биологии требует перевода генетической информации в функциональные белки. Как и во всех биологических системах, ген-перевод также предполагает измеримые ошибки. Оценки ошибок в переводе, как правило, указаны примерно в 1/10000 за кодон (обзор Ribas де пуплана и др.1). Тем не менее, процент ошибок сильно варьируется, от менее чем 10-5 до более чем 0/Codon1,2,3,4,5. Широкий диапазон ошибок, охватывающих более трех порядков величины, обусловлен тем фактом, что ошибки могут возникать в результате нескольких этапов в пути перевода: от стохастической, мутационной или вызванной стрессом ошибки в аминоацилляции6, 7 , 8 , 9 , 10, физиологический misacylation акоанилил-и глутаминил-tRNAs5, или рибосомальных декодирования ошибки2,3,11. В известной степени высокие показатели ошибок, представляющие более 0.01/Codon, предполагают, что переводные ошибки могут выполнять физиологические функции1,12 и что неправильный перевод может быть контекстно-специфичным13.
Мы и другие показали, что естественные ошибки при переводе генов могут быть адаптивными, особенно во время экологического стресса1,5,12,14,15,16 ,17,18. В микобактериях, ошибки, вызванные двухступенчатый косвенный глютамин/акогамин tRNA аминоацилляции путь19,20 результат в удивительно повышенной толерантности к первой линии антитуберкулезный антибиотик рифампицин 5. Таким образом, мы предположили, что уменьшение микобактериального неправильного перевода с небольшой молекулой может усиливать убийство рифампицин. Мы экранированный и определили естественные аминогликосайд касугамицин как соединение, которое может уменьшить Микобактериальный неправильный перевод, потенциат rifampicin опосредованное убийство микобактерий как в пробирке и в естественных условиях21, и ограничить возникновение рифампицин сопротивления21, которая угрожает глобальному контролю туберкулеза22 -самый смертоносный патоген в мире.
Для изучения трансляционной ошибки необходимо использовать методы измерения неправильного перевода. Есть несколько методов, которые были разработаны для измерения неправильного перевода, каждый с преимуществами и недостатками. Кратко, высокоточные массы на основе спектрометрии методы имеют несколько преимуществ, наиболее важным из которых является то, что с новыми алгоритмами для обнаружения нескольких типов трансляционной ошибки, относительно беспристрастной измерения неправильного перевода может быть выполнено18. Тем не менее, масс-спектрометрия не очень подходит для измерения деамирования события неправильного перевода-именно тип неверного перевода, который происходит в микобактерии из-за ошибок, подверженных косвенным tRNA aminoacylation пути. Это связано с высокой частотой неферментативной деамирования, возникающее при обработке образцов для масс-спектрометрии23, что приводит к чрезвычайно высокому фоновой сигналу. Таким образом, для обнаружения ошибок в этом пути, генетические усиления функции журналисты предлагают различные преимущества. Специфически, целесообразные Репортеры усиления-функции могут иметь весьма низкие показатели фона, позволяющ измерение очень низких тарифов ошибки11.
Так как проведение экспериментов с патогенными микобактериями туберкулеза требует специализированных средств и дополнительных мер предосторожности, мы проводим большинство экспериментов в непатогенной микобактерии м. сметматис — и показали ранее, что результаты между этими двумя видами в целом сопоставимы5,21. Для измерения неправильных ставок в микобактериях, генерируемых косвенным путем tRNA aminoacylation, мы модифицировали систему двойной люцифрации Ренилла-Светлячок, которая ранее разрабатываемой для измерения рибосомальных декодирования ошибок в E. coli 11 для использования в микобактериях. Мы сделали три конкретных изменения: оригинальный репортер не выразить эффективно в микобактерий, и, следовательно, последовательность была Codon-оптимизированы, и C-терминал три аминокислоты люциферазы светлячка, серин-лизин-лейцин, который был аннотированный как сигнал торговли в некоторых системах24, был изменен на изолейцин-аланин-валин25. Оригинальный репортер был критический остаток лизина в Светлячок люциферазы мутировал. Вместо этого, мы мутировали либо критически консервативны аспартат (D120) или глутамата (E144) остаток в Ренилла люциферазы для аапатина и глютамина, соответственно25 (рис. 1). Репортер был подклонирован в эпамальный тетрациклин-индусбл плазмид pUV-tetOR (см. таблицу материалов). Усиления-оф-функции журналисты мутировать критически консервативны функциональных остатков в ферментов/флуоресцентных белков, что делает их нефункциональные11,26. Поступательные (или теоретически, транскрипционные) ошибки, которые синтезируют функциональный вариант белка приведет к измерению активности фермента в подмножестве переведенных белков. Чтобы исправить для изменения в изобилии белка, мутировал репортер совыразил с функциональным белком, который действует в качестве ориентира и позволяет точного количественного определения усиления функции11. В то время как ренилла-Светлячок репортер двойного Люцифера позволило точного измерения конкретных Микобактериальный неправильный перевод ставки5,25 (рис. 2 и раздел 1 протокола), мы быстро понял, что это не подходит для среднего/высокой пропускной способностью скрининга молекул, что бы изменить скорость перевода. Это обусловлено главным образом двумя причинами, а именно: a) относительное отсутствие потенции Ренилла люциферазы означало, что минимум 1 мл микобактериальной культуры/образца была необходима для измерения перевода ставки, и б) требование для лизиса клеток до для измерения активности фермента требуется чрезмерная ручная обработка: микобактериальные клетки имеют толстую и многослойную клеточную стенку и конверт, который относительно устойчив к Лизу. Поэтому мы решили разработать новую систему получения прибыли от репортеров, которая могла бы использоваться с небольшими объемами (например, в системе 96-well) и не требовала для измерений лизиза клеток. Мы использовали сильнодействующие Нлюк люциферазы и определили критический аспартат осадок, который, видоизмененная для агопатина, привел к потере 2 логов функции (рис. 1). Кроме того, небольшой размер nluc позволил ему иметь N-терминал секреции сигнала метки-от антигена 85 а, основные секретируется антиген в микобактерии27 -что позволит nluc быть выделяется в культуру супернатант и обойти требования для лизиза клеток. Эталонный белок, GFP, был выражен из того же промоутера, как мутировал Нлюк, но с интегрированным вектором (см. таблицу материалов), и может быть измерен в неповрежденном клетки21 (рис. 3). Несмотря на эти преимущества, репортер Nluc/GFP (раздел 2 протокола) также имеет недостатки: относительно скромное снижение активности Нлюка (в 100 раз) с D140N мутацией не позволит измерение крайне низкой скорости перевода, что делает репортера более подходящим в качестве инструмента скрининга, чем для точных измерений трансляционной ошибки. Кроме того, Нлюк не имеет критических остатков глутамата; Таким образом, могут быть измерены только показатели ошибок ааспартат. Общие принципы, описанные в этой работе должны позволить исследователям либо использовать эти журналисты, как мы сделали или изменить журналистам по мере необходимости для точного и/или поверхностное измерение других конкретных трансляционных ошибок в их модели системы Выбор.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь протокол может быть адаптирован для измерения уровня неправильных переводов в самых разнообразных организмах. Существует ряд соображений, которые следует учитывать при адаптации протокола к другим системам. Во-первых, необходимо рассмотреть цель измерения. Для точного измерения количества неправильных переводов с использованием репортеров усиления функции требуется (a) надежный анализ считывания (например, ферментативной функции [в данном случае, активность люциферазы] с широким линейным диапазоном). Кроме того, ищите (б) потерю функции мутации в критическом остатке репортера белка, что приводит к очень существенной потере функции, ниже ожидаемого уровня неправильного перевода. Например, если ожидаемый коэффициент неправильных переводов будет измеряться примерно в 10-3/Codon, то потеря функции мутации должна быть больше, чем в 1 000 раз; в противном случае, более низкий диапазон неправильных переводов не будет обнаружен чутко. Наконец, для точного измерения количества неправильных переводов с использованием репортеров усиления функции, (c) необходим надежный эталонный репортер — в данном случае, люциффераза для раздела 1 протокола. В идеале, эталонный репортер должен быть сливается с мутировал ферментативного репортера, гарантируя (для всех намерений и целей), что они оба выражаются в уравнимиполярных отношений. Эталонный (и первичный репортер) считывание должно быть устойчивым к возмущениям воздействию окружающих сред. Например, Флуоресценция дикого типа GFP сильно подвержена возмущениям в результате изменений рН28, что делает ее непригодной в качестве эталона для измерения неправильных показателей в фагоцитированного микобактерий в макропагах, которые находятся в фагосомами, которые ниже рН 729. С другой стороны, для таких приложений, как скрининг малых молекул, наиболее важными соображениями для первичного экрана будет воспроизводимость измерений (т.е. точность, в отличие от точности), минимизация ручного управления и небольшие томов культуры. Точные измерения показателей неправильных переводов менее важны и могут быть выполнены в качестве вторичных анализов. Наконец, следует отметить, что журналисты, описанные в этом протоколе, основанные на ферментативной функции энзимов люциферазы, будут измерять только среднее количество неправильных переводов бактериальной популяции, но не могут дать информацию об неоднородности одноклеточных вариации в неправильных переводя ставок. Учитывая важность одноклеточной изменчивости в адаптивных фенотипов30,31,32, флуоресцентные Репортеры для измерения неправильных событий были разработаны12,33 , в том числе для измерения неправильного перевода в микобактерии5.
Приняв во внимание требования к измерению неправильного перевода, следует отметить, что генетический репортёры, подобные описанным в данном протоколе, могут измерять только один тип неправильного перевода (например, одна аминокислотная замена для одного Codon) на одного репортера. Поэтому для измерения различных случаев неправильного перевода требуются несколько репортеров. Например, для измерения неверного перевода рибосомальных декодирования ошибок близкого родственного кодонов lysyl-tRNA на одной позиции, не менее 16 репортеров требуются2,3,11. Высокоточная массовая спектрометрия и биоинформатика позволяют идентифицировать множество различных типов неправильных переводов одновременно18; Однако эти методы также поставляются с оговорками. В целом они менее точны, чем Репортеры, обладающие функцией усиления функции. Кроме того, как отмечалось ранее, они менее пригодны для обнаружения определенных типов неправильных переводов, а именно тех, которые могут быть объединены с неферментативной деамицией23. Наконец, масс-спектрометрия непригодна для скрининга на средне-или высокую пропускную способность.
Для адаптации этих репортеров и протоколов для измерения неправильного перевода в других системах, дальнейшие соображения включают надежное выражение репортера в желаемой модельной системе. Изначально мы пытались использовать систему двойного Люцифера, которая была разработана Фараббо и коллегами в нашей микобактериальной системе без изменений, но не имела успеха из-за недостатка выражения журналиста. Обширная устранение неполадок определили, что как Кодона-оптимизация и незначительные изменения последовательности журналисты должны были обеспечить надежное выражение25 (и см. выше). Вполне возможно, что подобная адаптация репортеров будет необходима для использования в других системах.
Наконец, следует учесть тип измеряемого события неправильного перевода. Например, если есть необходимость в измерении стоп-Кодона переадресации (подавление ерунды), в некритичном регионе основного белка-репортера34необходимо ввести потерю функции «стоп кодон». В противном случае, только определенные глупости подавления событий, которые восстановить критический остаток (и, следовательно, функция репортера) будет измеряться анализа, что потенциально может привести к существенной недооценки истинных ставок неправильного перевода. Появляется все больше свидетельств того, что поступательная ошибка играет возможную адаптивную роль в большом количестве организмов1,12,13,35. Однако измерение случаев неправильного перевода все еще ограничивается небольшим, хотя и растущим числом видов моделей. Адаптация чувствительных методов к измерению неправильного перевода может еще больше усилить понимание учеными роли ошибки перевода в физиологии и патологии.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддержилась за счет грантов фонда Билла и Мелинды Гейтс (OPP1109789), национального фонда естественных наук Китая (31570129), и начальных фондов школы медицины Университета Цинхуа для биджей Би Джей является Уэллком траст Следователь (207487/Z/17/Z).
Materials
| Middlebrook 7H9 | BD Difco | 271310 | |
| anhydrotetracycline | Cayman Chemical | 10009542 | |
| kasugamycin | sigma | K4013 | |
| Dual-luciferase reporter assay system | promega | E1960 | |
| Nano-Glo luciferase assay | promega | N1120 | |
| Fluoroskan Ascent FL luminometer | Thermo | / | |
| Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid | Costar | 3922 | |
| Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid | Costar | 3925 | |
| 96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid | Costar | 3599 | |
| Non-commercial reagents (plasmids) | |||
| pUV-TetOR-RenFF | NA | NA | episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter |
| pUV-TetOR-Ren-D120N-FF | dual-luciferase reporter with mutated Renilla | ||
| pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N | NA | NA | episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase |
| pMC1S-GFP | NA | NA | Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP |
References
- Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B. Protein mistranslation: friend or foe. Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 355-362 (2014).
- Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase. Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).
- Manickam, N., Nag, N., Abbasi, A., Patel, K., Farabaugh, P. J. Studies of translational misreading in vivo show that the ribosome very efficiently discriminates against most potential errors. RNA. 20 (1), 9-15 (2014).
- Netzer, N., et al. Innate immune and chemically triggered oxidative stress modifies translational fidelity. Nature. 462 (7272), 522-526 (2009).
- Su, H. W., et al. The essential mycobacterial amidotransferase GatCAB is a modulator of specific translational fidelity. Nature Microbiology. 1 (11), 16147 (2016).
- Li, L., et al. Naturally occurring aminoacyl-tRNA synthetases editing-domain mutations that cause mistranslation in Mycoplasma parasites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9378-9383 (2011).
- Li, L., et al. Leucyl-tRNA synthetase editing domain functions as a molecular rheostat to control codon ambiguity in Mycoplasma pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3817-3822 (2013).
- Ling, J., Soll, D. Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4028-4033 (2010).
- Raina, M., et al. Reduced amino acid specificity of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is associated with elevated mistranslation of Tyr codons. Journal of Biological Chemistry. , (2014).
- Wu, J., Fan, Y., Ling, J. Mechanism of oxidant-induced mistranslation by threonyl-tRNA synthetase. Nucleic Acids Research. 42 (10), 6523-6531 (2014).
- Kramer, E. B., Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. RNA. 13 (1), 87-96 (2007).
- Evans, C. R., Fan, Y., Weiss, K., Ling, J. Errors during Gene Expression: Single-Cell Heterogeneity, Stress Resistance, and Microbe-Host Interactions. mBio. 9 (4), (2018).
- Mohler, K., Ibba, M. Translational fidelity and mistranslation in the cellular response to stress. Nature Microbiology. 2, 17117 (2017).
- Bullwinkle, T. J., et al. Oxidation of cellular amino acid pools leads to cytotoxic mistranslation of the genetic code. Elife. 3, (2014).
- Fan, Y., et al. Heterogeneity of Stop Codon Readthrough in Single Bacterial Cells and Implications for Population Fitness. Molecular Cell. 67 (5), 826-836 (2017).
- Fan, Y., et al. Protein mistranslation protects bacteria against oxidative stress. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1740-1748 (2015).
- Schwartz, M. H., Pan, T. Temperature dependent mistranslation in a hyperthermophile adapts proteins to lower temperatures. Nucleic Acids Research. 44 (1), 294-303 (2016).
- Schwartz, M. H., Waldbauer, J. R., Zhang, L., Pan, T. Global tRNA misacylation induced by anaerobiosis and antibiotic exposure broadly increases stress resistance in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Curnow, A. W., et al. Glu-tRNAGln amidotransferase: a novel heterotrimeric enzyme required for correct decoding of glutamine codons during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (22), 11819-11826 (1997).
- Rathnayake, U. M., Wood, W. N., Hendrickson, T. L. Indirect tRNA aminoacylation during accurate translation and phenotypic mistranslation. Current Opinion in Chemical Biology. 41, 114-122 (2017).
- Chaudhuri, S., et al. Kasugamycin potentiates rifampicin and limits emergence of resistance in Mycobacterium tuberculosis by specifically decreasing mycobacterial mistranslation. eLife. 7, (2018).
- Toosky, M., Javid, B. Novel diagnostics and therapeutics for drug-resistant tuberculosis. British Medical Bulletin. 110 (1), 129-140 (2014).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Deamidation of human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12409-12413 (2001).
- Miura, S., et al. Urate oxidase is imported into peroxisomes recognizing the C-terminal SKL motif of proteins. European Journal of Biochemistry. 223 (1), 141-146 (1994).
- Javid, B., et al. Mycobacterial mistranslation is necessary and sufficient for rifampicin phenotypic resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 1132-1137 (2014).
- Wong, S. Y., et al. Functional role of methylation of G518 of the 16S rRNA 530 loop by GidB in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (12), 6311-6318 (2013).
- Wiker, H. G., Harboe, M. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis. Microbiological Reviews. 56 (4), 648-661 (1992).
- Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6, 28166 (2016).
- Li, H., Wu, M., Shi, Y., Javid, B. Over-Expression of the Mycobacterial Trehalose-Phosphate Phosphatase OtsB2 Results in a Defect in Macrophage Phagocytosis Associated with Increased Mycobacterial-Macrophage Adhesion. Frontiers in Microbiology. 7, 1754 (2016).
- Aldridge, B. B., et al. Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility. Science. 335 (6064), 100-104 (2012).
- Rego, E. H., Audette, R. E., Rubin, E. J. Deletion of a mycobacterial divisome factor collapses single-cell phenotypic heterogeneity. Nature. 546 (7656), 153-157 (2017).
- Zhu, J. H., et al. Rifampicin can induce antibiotic tolerance in mycobacteria via paradoxical changes in rpoB transcription. Nature Communications. 9 (1), 4218 (2018).
- Lant, J. T., et al. Visualizing tRNA-dependent mistranslation in human cells. RNA Biology. 15 (4-5), 567-575 (2018).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4 (4), 479-486 (1998).
- Melnikov, S. V., van den Elzen, A., Stevens, D. L., Thoreen, C. C., Soll, D. Loss of protein synthesis quality control in host-restricted organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
