JoVE Journal > Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Medición de tasas de desconfianza micobacterianas específicas con sistemas de reportera de ganancia de función

Published: April 26, 2019
doi:
10.3791/59453
, , ,
1Centre for Global Health and Infectious Diseases, Collaborative Innovation Centre for the Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases,Tsinghua University School of Medicine

Summary

En este artículo, presentamos dos métodos complementarios para medir tasas específicas de error traslacional y de desconfianza en el modelo Mycobacterium, Mycobacterium Smegmatis, utilizando sistemas de reportera de ganancia de función. Los métodos se pueden emplear para medir las tasas de error exactas en el bajo rendimiento o las tasas de error relativas en una configuración de más alto rendimiento.

Abstract

La traducción de genes a proteínas es propensa a errores. Aunque se estima que la tasa promedio de error traslacional en los sistemas modelo es de 1/10000 por codón, las tasas de error reales varían ampliamente, dependiendo de la especie, el medio ambiente y los codions que se estudian. Hemos demostrado previamente que las micobacterias utilizan una vía de dos pasos para la generación de glutamina aminoacilada y tRNAs de asparagina y que esto se asocia específicamente con tasas de error relativamente altas debido a la modulación de las tasas de desconfianza por un componente esencial de la vía, la amidotransferasa GatCAB. Modificamos un sistema de doble luciferasa Renilla-luciérnaga previamente empleado que se había utilizado para medir las tasas de desconfianza en Escherichia coli para su uso en micobacterias para medir las tasas de desconfianza específicas del glutamato en glutamina el bacalao y el aspartato para los cocoleones. Aunque este sistema de reportera era adecuado para la estimación precisa de tasas de error específicas, la falta de sensibilidad y los requisitos para los pasos de manipulación excesiva lo hizo inadecuado para aplicaciones de alto rendimiento. Por lo tanto, desarrollamos un segundo sistema de reportera de ganancia de función, usando Nluc luciferasa y proteína fluorescente verde (GFP), que es más susceptible a ajustes de rendimiento medio/alto. Usamos este sistema para identificar la Kasugamicina como una molécula pequeña que puede disminuir la desconfianza micobacteriana. Aunque los reporteros que Describimos aquí se han utilizado para medir tipos específicos de desconfianza micobacterianas, pueden modificarse para medir otros tipos de desconfianza en una serie de sistemas modelo.

Introduction

El flujo de información en biología molecular requiere la traducción de la información genética a proteínas funcionales. Al igual que con todos los sistemas biológicos, la traducción génica también implica errores medibles. Las estimaciones de las tasas de error en la traducción se citan típicamente como aproximadamente 1/10000 por codón (revisado por Ribas de Pouplana et al.1). Sin embargo, las tasas de error varían ampliamente, de menos de 10-5 a más de 0.05/codón1,2,3,4,5. La amplia gama de tasas de error, que abarcan más de tres órdenes de magnitud, se debe al hecho de que los errores pueden surgir de varios pasos en la vía de traducción: de los errores estocásticos, mutacionales o inducidos por el estrés en la aminoacilación6, 7 , 8 , 9 , 10, misacilación fisiológica de asparaginyl-y glutaminyl-tRNAs5, o errores de decodificación ribosomal2,3,11. Las tasas de error mensurablemente altas, que representan más de 0,01/codón, sugirieron que los errores traslacionales pueden realizar funciones fisiológicas1,12 y que la desconfianza puede ser específica del contexto13.

Nosotros y otros hemos demostrado que los errores que ocurren naturalmente en la traducción génica pueden ser adaptables, especialmente durante el estrés ambiental1,5,12,14,15,16 ,17,18. En las micobacterias, los errores generados por la vía indirecta de glutamina/asparagina tRNA aminoaciación de dos pasos19,20 resultan en una tolerancia notablemente mayor para el antibiótico antituberculosa de primera línea rifampicina 5. por lo tanto, especulamos que la disminución de la desconfianza micobacteriana con una molécula pequeña puede potenciar la matanza por rifampicina. Se proyectó e identificó la Kasugamicina de aminoglucósidos de origen natural como un compuesto que podría disminuir la desconfianza micobacteriana, potenciar la matanza mediada por rifampicina de las micobacterias tanto in vitro como in vivo21, y limitar la aparición de la resistencia a la rifampicina21, que amenaza el control global de la tuberculosis22 , el patógeno más mortal del mundo.

Para estudiar el error traslacional, se deben emplear métodos para la medición de la desconfianza. Existen múltiples métodos que se han desarrollado para la medición de la desconfianza, cada uno con ventajas y desventajas. Brevemente, los métodos basados en espectrometría de masas de precisión tienen varias ventajas, la más importante de las cuales es que con algoritmos más nuevos para la detección de múltiples tipos de error traslacional, una medición relativamente imparcial de la desconfianza puede ser realizado18. Sin embargo, la espectrometría de masas no es muy adecuada para la medición de los eventos de desamición de la desconfianza, precisamente el tipo de desconfianza que ocurre en las micobacterias debido a la vía de aminoacilación indirecta de tRNA, propenso a errores. Esto se debe a la desamidación no enzimática de alta frecuencia que se produce en el procesamiento de muestras para la espectrometría de masas23, lo que resulta en una señal de fondo extremadamente alta. Por lo tanto, para la detección de errores en esta vía, los reporteros genéticos de ganancia de función ofrecen ventajas distintivas. Específicamente, los reporteros de ganancia de función adecuados pueden tener tasas de fondo extremadamente bajas, lo que permite la medición de tasas de error muy bajas11.

Dado que realizar experimentos con Mycobacterium tuberculosis patógena requiere instalaciones especializadas y precauciones adicionales, realizamos la mayoría de los experimentos en la micobacteria no patógena M. smegmatis , y hemos demostrado anteriormente que los resultados entre las dos especies son ampliamente comparables5,21. Para medir las tasas de desconfianza en las micobacterias generadas por la vía de aminoacilación indirecta de tRNA, modificamos un sistema de doble luciferasa Renilla-luciérnaga que había sido desarrollado previamente para medir los errores de decodificación ribosomal en E. coli 11 para uso en micobacterias. Hicimos tres modificaciones específicas: el reportero original no expresaba eficientemente en las micobacterias, y por lo tanto, la secuencia estaba optimizada para el coco, y el C-terminal tres aminoácidos de luciferasa Firefly, serina-lisina-leucina, que ha sido anotado como señal de tráfico en algunos sistemas24, fue modificado a isoleucina-alanina-valina25. El reportero original tenía un residuo crítico de lisina en la luciferasa Firefly mutado. En cambio, hemos mutado un residuo de aspartato (D120) o glutamato (E144) que se conserva críticamente en la Renilla luciferasa a asparagina y glutamina, respectivamente,25 (figura 1). El reportero fue subclonado en el plásmido epimal inducible por tetraciclina (ver la tabla de materiales). Los reporteros de ganancia de función mutan conservan de manera crítica los residuos funcionales en las enzimas/proteínas fluorescentes que los hace no funcionales11,26. Los errores traslacionales (o teóricamente, transcripcionales) que sintetizan la variante funcional de la proteína provocaría una actividad enzimática medible en un subconjunto de proteínas traducidas. Para corregir la variación en la abundancia de proteínas, el reportero mutado está coexpresado con una proteína funcional que actúa como un punto de referencia y permite la cuantificación precisa de la ganancia de la función11. Mientras que el reportero de doble luciferasa Renilla-luciérnaga permitió la medición precisa de las tasas de desconfianza micobacterianas específicas5,25 (figura 2 y sección 1 del Protocolo), rápidamente se dio cuenta de que no es adecuado para el cribado de moléculas de medio/alto rendimiento que alteraría la tasa de desconfianza. Esto se debe principalmente a dos razones, a saber, a) la relativa falta de potencia de Renilla luciferasa significaba que se requería un mínimo de 1 ml de cultivo/muestra micobacteriana para medir las tasas de desconfianza, y b) el requisito de lisis de las células antes a la medición de la actividad enzimática requería una manipulación manual excesiva: las células micobacterianas tienen una pared celular gruesa y multicapa y un sobre que es relativamente resistente a la lisis. Por lo tanto, buscamos desarrollar un nuevo sistema de reportero de ganancia de función que podría ser utilizado con pequeños volúmenes (por ejemplo, en un sistema de placas de pozo de 96) y no requiere célula-lisis para las mediciones. Usamos la altamente potente Nluc luciferasa e identificamos un residuo de aspartato crítico que, cuando se mutó a Asparagina, resultó en 2 registros de pérdida de la función (figura 1). Además, el pequeño tamaño de Nluc le permitía tener una etiqueta de señal de secreción N-terminal — desde el antígeno 85A, un antígeno secretado importante en las micobacterias27 — que permitiría que nluc fuera secretada en sobrenadante de la cultura y eludieran el requisito de lisis celular. La proteína de referencia, GFP, se expresó desde el mismo promotor que el mutado Nluc, pero a partir de un vector integrado (ver la tabla de materiales), y se podría medir en las células intactas21 (figura 3). A pesar de estas ventajas, el reportero de Nluc/GFP (sección 2 del Protocolo) también tiene desventajas: la reducción relativamente modesta de la actividad de Nluc (100 veces) con la mutación D140N no permitiría la medición de tasas de desconfianza extremadamente bajas, haciendo que el reportero sea más adecuado como herramienta de cribado que para las mediciones precisas del error traslacional. Además, Nluc no tiene residuos críticos de glutamato; por lo tanto, sólo se podrían medir las tasas de error de asparagina-a-aspartato. Los principios generales descritos en este trabajo deben permitir a los investigadores utilizar a estos reporteros como hemos hecho o modificar a los reporteros según sea apropiado para una medición precisa y/o fácil de otras tasas de error translacional específicas en su sistema modelo de Elección.

Protocol

1. Renilla-Firefly dual-luciferase Reporter Nota: Para obtener una representación visual de este método, vea la figura 2. Inocular cepas de reportera micobacteriana de-80 ° c con 2 mL de medio 7H9. La doble luciferasa de tipo salvaje, así como las cepas mutadas de Renilla (reportera), deben utilizarse para permitir el cálculo de las tasas de desconfianza (ver paso 1,7). Agitar a 37 ° c durante 1 a 2 días hasta que OD600 alcance la fase estacionaria (OD > 3). Alícuota y diluir a OD600Nm alrededor de 0,1-0,5. Para los experimentos típicos, utilice tres cultivos de réplicas biológicas independientes. Anhydrotetracycline (ATC), un inductor analógico de tetraciclina de expresión de reportero (que es controlado por un promotor inducible por tetraciclina) a una concentración final de 50 ng/mL. Para medir los efectos de la Kasugamicina en las tasas de destraducción21, añadir diferentes dosis de Kasugamicina al cultivo (ver figura 4 para las dosis indicadas) al mismo tiempo (en las dosis probadas, la Kasugamicina no tiene actividad antimicrobiana). Tenga en cuenta que es importante incluir al menos un control no inducido para cada reportero. Cultivo-inducir cultivos para 4-6 h a 37 ° c con agitación. Transfiera los cultivos bacterianos a un tubo de 2 mL, y centrifugue a 3.220 x g durante 5 min a temperatura ambiente para precipitan las bacterias. Deseche el sobrenadante. Interrumpir la bacteria añadiendo 40 μL de 1x tampón de lisis pasiva (suministrado por un kit de doble luciferasa), que se ha diluido (1:1) en agua destilada doble. Transfiera el lisado bacteriano resuspendido a una placa blanca 96-Well, una bien por muestra, y agite a temperatura ambiente durante 20 min.PRECAUCIÓN: No sobreincubar las bacterias en el tampón de lisis (durante más de 30 min). Añadir 80 μL de sustrato de luciérnaga a cada pozo, agitar durante 15 s, y medir la luminiscencia por el luminómetro con 1.000 MS como tiempo de integración. Utilice un inyector automatizado o una picada multicanal para evitar errores de pipeteo. Añadir 80 μL de sustrato de Renilla a cada pozo, agitar durante 15 s, y medir la luminiscencia por luminómetro con 1.000 MS como tiempo de integración. Restar la luminiscencia de fondo-medido utilizando cualquiera de tipo salvaje M. smegmatis (es decir, no contiene reporteros) o lysate reportero no inducido-a partir de los valores medidos. Utilice los valores corregidos para calcular las tasas de desconfianza de cada condición utilizando la siguiente ecuación11,25, donde DN se refiere a la actividad en la cepa de reportero mutado: 2. nluc/GFP Reporter Nota: Para obtener una representación visual de este método, vea la figura 3. Inocular la cepa de reportera bacteriana a partir de-80 ° c con 2 mL de medio 7H9. Agitar a 37 ° c durante 1 a 2 días hasta que OD600 alcance la fase estacionaria (OD > 3). Subcultura a 50 mL de medio 7H9 y crecer hasta OD600 alcanza la fase estacionaria tardía (> 4). Antes de alicitar las bacterias a una placa de pozo de 96, añadir ATC en una concentración final de 50 ng/mL y mezclar bien. La inducción del cultivo a granel asegura que todos los pozos contengan la misma cantidad de inductor y que la inducción del reportero esté sincronizada. Alícuota de la bacteria a una placa transparente, de fondo redondo 96-pozo, con 100 μL de volumen en cada pozo. Para la pantalla de moléculas pequeñas que afecten a las tasas de desconfianza, agregue el compuesto a la concentración indicada para seleccionar pozos. Para los fines de este protocolo, utilice Kasugamicina (a dosis indicadas en la figura 5) como ilustración. Añadir diferentes dosis de Kasugamicina para seleccionar pozos (cada grupo experimental debe contener al menos dos réplicas biológicas). Agitar e inducir las muestras a 37 ° c para 16-20 h.Nota: Es necesario sellar el plato con película. Además, todos los pozos de borde deben llenarse con al menos 200 μL de agua estéril para limitar la evaporación de los pozos de prueba. Tomar 80 μL de cada pozo, utilizando una picada multicanal, y transferir las muestras a una placa de 96-pozo negro (que maximiza la medición de la señal de fluorescencia). Mida la señal GFP por el luminómetro con 20 ms como tiempo de integración. Después de medir la señal GFP, centrifugar la placa a 3.220 x g durante 10 min. transferir 50 μl del sobrenadante a una placa de 96-Well con fondo blanco (que maximiza la medición de la señal de luminiscencia), añadir 50 μl de sustrato de nluc a cada pozo, mezclarlos bien, y medir la luminiscencia por el luminómetro con 1.000 MS como tiempo de integración. Determine la relación Nluc/GFP dividiendo los valores de luminiscencia de Nluc corregidos por fluorescencia de GFP: esta medida (en unidades arbitrarias) es una medida relativa de aspartato para la destraducción de asparagina.

Representative Results

En la figura 1se muestra un dibujo animado que ilustra el esquema general de los dos sistemas de reportera utilizados en este trabajo. En la figura 2 se muestra un resumen de la sección 1 del protocolo y un resumen de la sección 2 de la figura 3. El efecto de la Kasugamicina en la desconfianza micobacteriana se muestra en la figura 4, medida por el sistema de reportera Renilla-luciérnaga. Para mostrar la especificidad de la acción Kasugamicina, el reportero también se expresó en una cepa de M. smegmatis en la que se eliminó ksga (∆ ksga). La KsgA es un rRNA dimetiltransferasa, y las cepas eliminadas por ksgason relativamente resistentes a la Kasugamicina. La acción de Kasugamicina sobre la destraducción también se midió con el reportero Nluc/GFP, como se muestra en la figura 5. Figura 1 : Dibujos animados que ilustran los dos sistemas de reportero de ganancia de función. (A) el sistema de reportera Renilla-luciérnaga está compuesto por dos enzimas luciferasas expresadas como una proteína de fusión y bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina. La expresión de la enzima dual de tipo silvestre resulta en una alta actividad medible tanto de Renilla como luciferasas de luciérnaga (arriba). La mutación de un residuo de aspartato crítico, D120, en Renilla a Asparagina, hace que la enzima Renilla (D120N) esté inactiva, pero luciferasa Firefly sigue activa. La desconfianza de asparagina a aspartato (en este caso, de ASP-tRNAASN tRNA5,21fisiológicamente misacilada) resulta en una pequeña proporción de las proteínas de Renilla traducidas ganando actividad, que se puede medir. La comparación de la actividad Renilla/luciérnaga del reportero mutado en comparación con la enzima dual de tipo silvestre permite el cálculo de la asparagina a una tasa de desconfiación de aspartato. (B) el sistema de reportera nluc/GFP opera con un principio similar. El gen mutado Nluc (D140N) tiene una señal de secreción N-terminal derivada del antígeno 85A, una proteína micobacteriana secretada importante. Tanto los genes nluc como los GFP se expresan a partir de promotores idénticos inducibles por tetraciclina, para permitir el uso de GFP como referencia de expresión relativa. Tenga en cuenta la falta de la cepa de control Nluc de tipo salvaje: este reportero se utiliza principalmente en la detección, donde las mediciones de las tasas de desconfianza relativas son suficientes para la pantalla primaria. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Esquema de medición de la tasa de desconfianza utilizando el reportero Renilla-Firefly (sección 1 del Protocolo). Se cultivan cultivos frescos de M. smegmatis, transformados con un plásmido que expresa a los periodistas de doble luciferasa. La expresión del reportero es inducida, y se prueban los compuestos o condiciones de investigación. Después de 4-6 h de expresión de reportero, las culturas son peladas y lisadas y los lisatos se prueban para la actividad de la luciferasa dual. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Esquema de medición de la tasa de desconfianza de Nluc-GFP reportero (sección 2 del Protocolo). Una cultura fresca de M. smegmatis, transformada con los reporteros de nluc y GFP, se cultiva a un volumen suficiente para todas las placas a probar (suponiendo ~ 10 ml/96-placa de pozo). Inmediatamente antes de pipetear el cultivo bacteriano en cada pozo, inducir la expresión de los reporteros con ATC añadido a la cultura a granel. Incubar los pozos agitándolos durante la noche. Para medir las tasas de desconfianza relativas, transfiera los cultivos a una placa negra (para aumentar la sensibilidad de la detección de fluorescencia), mida la fluorescencia de GFP, y luego, gire las placas hacia abajo para pellets de las bacterias. Transfiera el sobrenadante a una placa blanca para la medición de la actividad de Nluc. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : Resultado representativo del uso de la reportera Renilla-luciérnaga midiendo la tasa de desconfianza en presencia de Kasugamicina en diferentes cepas. Tasas de destraducción de aspartato en (A) tipo M. smegmatis silvestre y (B) una cepa eliminada para ksga (∆ ksga) tras el tratamiento con Kasugamicina (KSG) medido por la Renilla-luciérnaga dual Reportero. Las culturas se trataron con Kasugamicina a dosis indicadas (en microgramos/mililitro) durante 6 h antes de la lisis celular y las mediciones. Las relaciones de Ren/FF corregidas (ejes y) son indicativos del aspartato para las tasas de desconfianza de la asparagina. La eliminación de Ksga da como resultado una tasa de desconfianza de línea base más alta, que es más resistente a la modulación por Kasugamicina. Las barras indican los valores de la media, con la desviación estándar como error. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5 : Resultado representativo del uso del reportero Nluc-GFP que mide la tasa de desconfianza en presencia de Kasugamicina. Tasas de desconfiación relativa de aspartato en el tipo de M. smegmatis silvestres según lo medido por el reportero nluc/GFP, después del tratamiento con Kasugamicina (KSG) durante la noche (16 h). Las barras indican los valores de la media, con la desviación estándar como error. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El protocolo descrito aquí se puede adaptar para la medición de las tasas de desconfianza en una amplia variedad de organismos. Hay una serie de consideraciones que deben tenerse en cuenta al adaptar el protocolo a otros sistemas. En primer lugar, debe tenerse en cuenta el propósito de la medición. Para la medición precisa de las tasas de desconfianza utilizando reporteros de ganancia de función, lo que se necesita es (a) un ensayo de lectura robusto (p. ej., función enzimática [en este caso, actividad luciferasa] con un amplio rango lineal). Además, busque (b) una mutación de pérdida de función en un residuo crítico de la proteína reportera que resulte en una pérdida de función muy significativa, por debajo de la tasa esperada de desconfianza. Por ejemplo, si la tasa de desconfianza esperada que se va a medir es aproximadamentede 10-3/codón, la mutación de pérdida de función debe ser mayor que 1.000-Fold; de lo contrario, la gama más baja de eventos de desconfianza no se detectará con sensibilidad. Por último, para la medición precisa de las tasas de desconfianza utilizando reporteros de ganancia de función, (c) se necesita un reportero de referencia robusto — en este caso, luciferasa Luciérnaga para la sección 1 del protocolo. Idealmente, el reportero de referencia debe fusionarse con el reportero enzimático mutado, garantizando (a todos los efectos) que ambos se expresan en proporciones equimolares. La lectura de referencia (y el reportero principal) debe ser robusta para las perturbaciones en entornos expuestos. Por ejemplo, la fluorescencia del GFP de tipo silvestre es altamente susceptible a la perturbación por los cambios en el pH28, por lo que es inadecuado como punto de referencia para la medición de las tasas de desconfianza en las micobacterias fagocitosas en macrófagos, que residen en fagosomas que están por debajo del pH 729. Por otro lado, para aplicaciones como el cribado de moléculas pequeñas, las consideraciones más importantes para una pantalla primaria serán la reproducibilidad de las mediciones (es decir, precisión, en contraposición a la precisión), la minimización de la manipulación manual y pequeñas volúmenes de cultivo. Las mediciones precisas de las tasas de desconfianza son menos importantes y se pueden realizar como ensayos secundarios. Finalmente, cabe señalar que los reporteros descritos en este protocolo, basados en la función enzimática de las enzimas luciferasa, sólo medirá las tasas de desconfianza media de una población bacteriana, pero no puede dar información sobre la heterogeneidad de una sola célula variación de las tasas de desconfianza. Dada la importancia de la variabilidad de una célula en los fenotipos adaptativos30,31,32, se han desarrollado reporteros fluorescentes para la medición de los eventos de desconfianza12,33 , incluso para la medición de la desconfianza en las micobacterias5.

Habiendo examinado los requisitos para la medición de la desconfianza, debe tenerse en cuenta que los reporteros de la ganancia genética como se describe en este protocolo sólo pueden medir un tipo de desconfianza (es decir, una substitución de aminoácidos para una codón) por reportero. Por lo tanto, para la medición de diferentes eventos de desconfianza, se requieren varios reporteros. Por ejemplo, para la medición de la desconfianza por los errores de decodificación ribosomal de los copeos casi cognados por Lysyl-tRNA en una posición, al menos 16 reporteros son requeridos2,3,11. La espectrometría de masas de alta precisión y la bioinformática permiten la identificación potencial de muchos tipos diferentes de eventos de destraducción simultáneamente18; sin embargo, estos métodos también vienen con advertencias. En general, son menos precisos que los reporteros de ganancia de función. Además, como se indicó anteriormente, son menos adecuados para la detección de ciertos tipos de desconfianza, a saber, aquellos que podrían ser confunden con la desamición no enzimática23. Por último, la espectrometría de masas no es apta como lectura para el cribado de medio o alto rendimiento.

Para la adaptación de estos reporteros y protocolos para la medición de la desconfianza en otros sistemas, otras consideraciones incluyen una sólida expresión del reportero en el sistema modelo deseado. Inicialmente intentamos utilizar el sistema dual-luciferasa desarrollado por Farabaugh y colegas en nuestro sistema micobacteriano sin modificaciones, pero no tuvo éxito, debido a la falta de expresión de reportero. Una extensa solución de problemas identificó que tanto la optimización de codón como una modificación de secuencia menor de los reporteros debían permitir una sólida expresión25 (y ver más arriba). Es concebible que se requieran adaptaciones similares de los reporteros para su uso en otros sistemas.

Por último, debe tenerse en cuenta el tipo de evento de desconfianza que se está midiendo. Por ejemplo, si hay una necesidad de medir la lectura de STOP-codón (supresión de tonterías), la pérdida de la mutación de la función de detener codón debe introducirse dentro de una región no crítica de la proteína del reportero primario34. De lo contrario, solo los eventos específicos de supresión de tonterías que recuperen el residuo crítico (y, por lo tanto, la función de reportero) se medirán por el ensayo, lo que podría conducir a una subestimación sustancial de las verdaderas tasas de desconfianza. Existe una creciente evidencia de que el error traslacional desempeña un posible papel adaptativo en un gran número de organismos1,12,13,35. Sin embargo, la medición de los eventos de desconfianza se limita aún a un número pequeño, aunque creciente, de especies modelo. La adaptación de métodos sensibles para medir la desconfianza tiene el potencial de aumentar aún más la comprensión de los científicos sobre el papel del error de traducción en la fisiología y la patología.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado en parte por las donaciones de la Fundación Bill y Melinda Gates (OPP1109789), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31570129), y los fondos de puesta en marcha de la escuela de medicina de la Universidad Tsinghua a B.J. B.J. es una confianza Wellcome Investigador (207487/Z/17/Z).

Materials

Middlebrook 7H9 BD Difco 271310
anhydrotetracycline Cayman Chemical  10009542
kasugamycin sigma K4013
Dual-luciferase reporter assay system promega E1960
Nano-Glo luciferase assay promega N1120
Fluoroskan Ascent FL luminometer Thermo /
Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid Costar 3922
Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid Costar 3925
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid Costar 3599
Non-commercial reagents (plasmids)
pUV-TetOR-RenFF NA NA episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter
pUV-TetOR-Ren-D120N-FF dual-luciferase reporter with mutated Renilla
pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N NA NA episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase
pMC1S-GFP NA NA Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP
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References

  1. Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B. Protein mistranslation: friend or foe. Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 355-362 (2014).
  2. Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase. Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).
  3. Manickam, N., Nag, N., Abbasi, A., Patel, K., Farabaugh, P. J. Studies of translational misreading in vivo show that the ribosome very efficiently discriminates against most potential errors. RNA. 20 (1), 9-15 (2014).
  4. Netzer, N., et al. Innate immune and chemically triggered oxidative stress modifies translational fidelity. Nature. 462 (7272), 522-526 (2009).
  5. Su, H. W., et al. The essential mycobacterial amidotransferase GatCAB is a modulator of specific translational fidelity. Nature Microbiology. 1 (11), 16147 (2016).
  6. Li, L., et al. Naturally occurring aminoacyl-tRNA synthetases editing-domain mutations that cause mistranslation in Mycoplasma parasites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9378-9383 (2011).
  7. Li, L., et al. Leucyl-tRNA synthetase editing domain functions as a molecular rheostat to control codon ambiguity in Mycoplasma pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3817-3822 (2013).
  8. Ling, J., Soll, D. Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4028-4033 (2010).
  9. Raina, M., et al. Reduced amino acid specificity of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is associated with elevated mistranslation of Tyr codons. Journal of Biological Chemistry. , (2014).
  10. Wu, J., Fan, Y., Ling, J. Mechanism of oxidant-induced mistranslation by threonyl-tRNA synthetase. Nucleic Acids Research. 42 (10), 6523-6531 (2014).
  11. Kramer, E. B., Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. RNA. 13 (1), 87-96 (2007).
  12. Evans, C. R., Fan, Y., Weiss, K., Ling, J. Errors during Gene Expression: Single-Cell Heterogeneity, Stress Resistance, and Microbe-Host Interactions. mBio. 9 (4), (2018).
  13. Mohler, K., Ibba, M. Translational fidelity and mistranslation in the cellular response to stress. Nature Microbiology. 2, 17117 (2017).
  14. Bullwinkle, T. J., et al. Oxidation of cellular amino acid pools leads to cytotoxic mistranslation of the genetic code. Elife. 3, (2014).
  15. Fan, Y., et al. Heterogeneity of Stop Codon Readthrough in Single Bacterial Cells and Implications for Population Fitness. Molecular Cell. 67 (5), 826-836 (2017).
  16. Fan, Y., et al. Protein mistranslation protects bacteria against oxidative stress. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1740-1748 (2015).
  17. Schwartz, M. H., Pan, T. Temperature dependent mistranslation in a hyperthermophile adapts proteins to lower temperatures. Nucleic Acids Research. 44 (1), 294-303 (2016).
  18. Schwartz, M. H., Waldbauer, J. R., Zhang, L., Pan, T. Global tRNA misacylation induced by anaerobiosis and antibiotic exposure broadly increases stress resistance in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. , (2016).
  19. Curnow, A. W., et al. Glu-tRNAGln amidotransferase: a novel heterotrimeric enzyme required for correct decoding of glutamine codons during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (22), 11819-11826 (1997).
  20. Rathnayake, U. M., Wood, W. N., Hendrickson, T. L. Indirect tRNA aminoacylation during accurate translation and phenotypic mistranslation. Current Opinion in Chemical Biology. 41, 114-122 (2017).
  21. Chaudhuri, S., et al. Kasugamycin potentiates rifampicin and limits emergence of resistance in Mycobacterium tuberculosis by specifically decreasing mycobacterial mistranslation. eLife. 7, (2018).
  22. Toosky, M., Javid, B. Novel diagnostics and therapeutics for drug-resistant tuberculosis. British Medical Bulletin. 110 (1), 129-140 (2014).
  23. Robinson, N. E., Robinson, A. B. Deamidation of human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12409-12413 (2001).
  24. Miura, S., et al. Urate oxidase is imported into peroxisomes recognizing the C-terminal SKL motif of proteins. European Journal of Biochemistry. 223 (1), 141-146 (1994).
  25. Javid, B., et al. Mycobacterial mistranslation is necessary and sufficient for rifampicin phenotypic resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 1132-1137 (2014).
  26. Wong, S. Y., et al. Functional role of methylation of G518 of the 16S rRNA 530 loop by GidB in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (12), 6311-6318 (2013).
  27. Wiker, H. G., Harboe, M. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis. Microbiological Reviews. 56 (4), 648-661 (1992).
  28. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6, 28166 (2016).
  29. Li, H., Wu, M., Shi, Y., Javid, B. Over-Expression of the Mycobacterial Trehalose-Phosphate Phosphatase OtsB2 Results in a Defect in Macrophage Phagocytosis Associated with Increased Mycobacterial-Macrophage Adhesion. Frontiers in Microbiology. 7, 1754 (2016).
  30. Aldridge, B. B., et al. Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility. Science. 335 (6064), 100-104 (2012).
  31. Rego, E. H., Audette, R. E., Rubin, E. J. Deletion of a mycobacterial divisome factor collapses single-cell phenotypic heterogeneity. Nature. 546 (7656), 153-157 (2017).
  32. Zhu, J. H., et al. Rifampicin can induce antibiotic tolerance in mycobacteria via paradoxical changes in rpoB transcription. Nature Communications. 9 (1), 4218 (2018).
  33. Lant, J. T., et al. Visualizing tRNA-dependent mistranslation in human cells. RNA Biology. 15 (4-5), 567-575 (2018).
  34. Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4 (4), 479-486 (1998).
  35. Melnikov, S. V., van den Elzen, A., Stevens, D. L., Thoreen, C. C., Soll, D. Loss of protein synthesis quality control in host-restricted organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).

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Chen, Y., Pan, M., Chen, Y., Javid, B. Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems. J. Vis. Exp. (146), e59453, doi:10.3791/59453 (2019).
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