JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Meting van specifieke mycobacteriële verkeerde vertaaltarieven met winst-van-functie reporter systemen

Published: April 26, 2019
doi:
10.3791/59453
, , ,
1Centre for Global Health and Infectious Diseases, Collaborative Innovation Centre for the Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases,Tsinghua University School of Medicine

Summary

In dit artikel presenteren we twee complementaire methoden voor het meten van specifieke tarieven van translationele fout en verkeerde vertaling in het model Mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, met behulp van gain-of-functie reporter systemen. De methoden kunnen worden gebruikt om nauwkeurige foutenpercentages in lage doorvoer of relatieve foutenpercentages in een meer high-throughput instelling te meten.

Abstract

De vertaling van genen in eiwitten is gevoelig voor fouten. Hoewel de gemiddelde snelheid van translationele fout in modelsystemen wordt geschat op 1/10000 per codon, de werkelijke foutenpercentages variëren sterk, afhankelijk van de soort, het milieu, en codon wordt bestudeerd. We hebben eerder aangetoond dat mycobacteriën gebruik maken van een twee-stappen traject voor de generatie van aminoacylated glutamine en Asparagine tRNAs en dat dit specifiek wordt geassocieerd met relatief hoge foutenpercentages als gevolg van de modulatie van de verkeerde vertaling tarieven door een essentieel onderdeel van het pad, de amidotransferase GatCAB. We wijzigden een eerder aangewende Renilla-Firefly Dual-Luciferase systeem dat was gebruikt om de tarieven te meten verkeerde vertaling in Escherichia coli voor gebruik in mycobacteriën om specifieke verkeerde tarieven van glutamaat op glutamine te meten codon en aspartaat voor Asparagine codon. Hoewel dit reporter systeem geschikt was voor de nauwkeurige inschatting van specifieke foutenpercentages, maakte het gebrek aan gevoeligheid en vereisten voor overmatige manipulatie stappen het ongeschikt voor high-throughput toepassingen. Daarom ontwikkelden we een tweede gain-of-function reporter systeem, met behulp van Nluc Luciferase en groene fluorescerende eiwitten (GFP), die meer vatbaar is voor middelgrote/high-throughput instellingen. We gebruikten dit systeem om kasugamycine te identificeren als een klein molecuul dat kan afnemen mycobacteriële verkeerde vertaling. Hoewel de verslaggevers die we hier beschrijven zijn gebruikt om specifieke soorten mycobacteriële verkeerde vertaling te meten, kunnen ze worden gewijzigd om andere vormen van misvertaling te meten in een aantal modelsystemen.

Introduction

De informatiestroom in de moleculaire biologie vereist de vertaling van genetische informatie naar functionele eiwitten. Zoals met alle biologische systemen, de vertaling van het gen impliceert ook meetbare fouten. De ramingen van de fouten in vertaling worden typisch geciteerd als ongeveer 1/10000 per codon (herzien door Ribas de Pouplana et al.1). De foutenpercentages variëren echter sterk, van minder dan 10-5 tot meer dan 0,05/codon 1,2,3,4,5. Het brede scala van foutenpercentages, verspreid over meer dan drie ordes van grootte, is te wijten aan het feit dat fouten kunnen ontstaan uit meerdere stappen in het vertaaltraject: van stochastische, mutatie, of stress-geïnduceerde fouten in aminoacylation6, 7 , 8 , 9 , 10, fysiologische misacrylatie van asparaginyl-en glutaminyl-tRNAs5, of ribosomale decoderingfouten 2,3,11. De meetbaar hoge foutenpercentages, die meer dan 0.01/codon vertegenwoordigen, stelden voor dat translationele fouten fysiologische functies kunnen uitvoeren1,12 en dat de verkeerde vertaling context-specifieke13kan zijn.

Wij en anderen hebben aangetoond dat natuurlijk voorkomende fouten in de genen vertaling kunnen worden adaptief, met name tijdens de milieu-stress1,5,12,14,15,16 ,17,18. In mycobacteriën, fouten gegenereerd door de twee-stap indirecte glutamine/Asparagine tRNA aminoacylation pathway19,20 resulteren in een opmerkelijk verhoogde tolerantie voor de eerste lijn antituberculosis antibioticum rifampicin 5. Daarom hebben we gespeculeerd dat het afnemende mycobacteriële verkeerde vertaling met een klein molecuul kan versterken doden door rifampicin. We gescreend voor en identificeerde de van nature voorkomende aminoglycoside kasugamycine als een verbinding die zou kunnen afnemen mycobacteriële verkeerde vertaling, versterken rifampicin-gemedieerde doden van mycobacteriën zowel in vitro en in vivo21, en beperken de opkomst van rifampicin weerstand21, die de wereldwijde controle van tuberculose22 bedreigt-‘s werelds meest dodelijke ziekteverwekker.

Om translationele fout te bestuderen, moeten methoden voor de meting van de verkeerde vertaling worden gebruikt. Er zijn meerdere methoden die zijn ontwikkeld voor de meting van de verkeerde vertaling, elk met voordelen en nadelen. Kort, precisie massaspectrometrie-gebaseerde methoden hebben verschillende voordelen, de belangrijkste van die is dat met nieuwere algoritmen voor de opsporing van meerdere soorten van translationele fout, een relatief onbevooroordeelde meting van de verkeerde vertaling kan worden uitgevoerd18. Echter, massaspectrometrie is niet erg geschikt voor de meting van deamidie misvertaling gebeurtenissen-precies het type van de verkeerde vertaling die optreedt in mycobacteriën als gevolg van de foutgevoelige indirecte tRNA aminoacylation pathway. Dit komt door hoogfrequente niet-enzymatische deamidie die voorkomt bij de verwerking van monsters voor massaspectrometrie23, wat resulteert in een extreem hoge achtergrond signaal. Daarom, voor de opsporing van fouten in dit pad, genetische gain-of-functie reporters bieden verschillende voordelen. Specifiek, kunnen de geschikte winst-van-functie verslaggevers uiterst lage achtergrond tarieven hebben, die de meting van zeer lage foutenpercentages toestaan11.

Sinds het uitvoeren van experimenten met pathogene Mycobacterium tuberculose vereist gespecialiseerde faciliteiten en extra voorzorgsmaatregelen, voeren we de meeste experimenten in de niet-pathogeen Mycobacterium M. smegmatis- en hebben eerder aangetoond dat de resultaten tussen de twee soorten zijn in grote lijnen vergelijkbaar met5,21. Om te meten verkeerde vertaling tarieven in mycobacteriën gegenereerd door de indirecte tRNA aminoacylation pathway, hebben we een Renilla-Firefly Dual-Luciferase systeem dat eerder was ontwikkeld om te meten ribosomale decodering fouten in E. coli gewijzigd 11 voor gebruik in mycobacteriën. We hebben drie specifieke wijzigingen: de oorspronkelijke verslaggever niet efficiënt uitdrukken in mycobacteriën, en dus de volgorde werd codon-geoptimaliseerd, en de C-Terminal drie aminozuren van de Firefly Luciferase, serine-lysine-Leucine, die is geannoteerd als een handel signaal in sommige systemen24, werd aangepast aan Isoleucine-alanine-Valine25. De oorspronkelijke verslaggever had een kritische lysine residu in de Firefly Luciferase gemuteerd. In plaats daarvan hebben we gemuteerd ofwel een kritisch geconserveerd aspartaat (D120) of glutamaat (E144) residu in de Renilla Luciferase naar Asparagine en glutamine, respectievelijk25 (Figuur 1). De verslaggever werd ondergekloond in de episomal tetracycline-afleidbaar plasmide pUV-tetOR (Zie de lijst van materialen). Gain-of-functie verslaggevers muteren kritisch behouden functionele residuen in enzymen/TL-eiwitten die maakt ze niet-functionele11,26. Translationeel (of theoretisch, transcriptie) fouten die de functionele variant van het eiwit synthetiseren zou resulteren in meetbare enzymactiviteit in een subset van vertaalde eiwitten. Om voor variatie in eiwit overvloed te verbeteren, wordt de gemuteerde verslaggever samengezet met een functioneel proteïne dat als benchmark fungeert en voor nauwkeurige kwantificering van winst-van-functie11toestaat. Terwijl de Renilla-Firefly Dual-Luciferase verslaggever toegestaan voor de nauwkeurige meting van specifieke mycobacteriële verkeerde vertaling tarieven5,25 (Figuur 2 en deel 1 van het Protocol), we snel besefte dat het niet geschikt is voor medium/high-throughput screening van moleculen die zou veranderen de verkeerde vertaling tarief. Dit is voornamelijk te wijten aan twee redenen, namelijk a) het relatieve gebrek aan potentie van Renilla Luciferase betekende dat een minimum van 1 ml mycobacteriële cultuur/monster nodig was om de verkeerde omzettings cijfers te meten, en b) de eis voor Lysis van de cellen vóór aan de meting van de enzymactiviteit vereiste bovenmatige handbehandeling: de mycobacteriële cellen hebben een dikke en multi-layered celwand en een envelop die vrij bestand tegen Lysis is. Daarom hebben we gekeken naar een nieuwe gain-of-function reporter systeem dat kan worden gebruikt met kleine volumes (bijvoorbeeld in een 96-well plaatsysteem) te ontwikkelen en niet nodig lysis voor metingen. We gebruikten de zeer potente Nluc Luciferase en identificeerde een kritische aspartaat residu dat, wanneer gemuteerd tot asparagine, resulteerde in 2 logs verlies van functie (Figuur 1). Bovendien, de geringe omvang van Nluc toegestaan om een N-Terminal secretie signaal tag hebben-van antigeen 85A, een grote afgescheiden antigeen in mycobacteriën27 -dat zou toestaan Nluc worden uitgescheiden in cultuur bovendrijvende en omzeilen van de eis voor cel lysis. De benchmark Protein, GFP, werd uitgedrukt van dezelfde promotor als de gemuteerde Nluc, maar van een geïntegreerde vector (Zie de tabel van materialen), en kan worden gemeten in intacte cellen21 (Figuur 3). Ondanks deze voordelen heeft de Nluc/GFP Reporter (deel 2 van het Protocol) ook nadelen: de relatief bescheiden vermindering van de Nluc activiteit (100-voudig) met de D140N mutatie zou niet toelaten dat de meting van extreem lage verkeerde vertaaltarieven, het maken van de verslaggever meer geschikt als een screening tool dan voor de nauwkeurige metingen van de translationele fout. Bovendien heeft Nluc geen kritische glutamaat residuen; Daarom kunnen alleen Asparagine-to-aspartaat foutenpercentages worden gemeten. De algemene beginselen die in dit werk worden beschreven, moeten onderzoekers in staat stellen deze verslaggevers te gebruiken zoals we hebben gedaan of om verslaggevers te wijzigen, voor een nauwkeurige en/of gemakkelijke meting van andere specifieke vertaalfouten in hun modelsysteem van Keuze.

Protocol

1. Renilla-Firefly Dual-Luciferase verslaggever Opmerking: Voor een visuele weergave van deze methode, Zie Figuur 2. Inoculeren mycobacteriële reporter stammen van-80 °C voorraad met 2 mL 7H9 medium. Wild-type Dual-Luciferase, evenals gemuteerde Renilla (reporter) stammen, moet worden gebruikt om de berekening van de verkeerde vertaling tarieven mogelijk te maken (zie stap 1,7). Schud bij 37 °C voor 1 tot 2 dagen tot OD600 de stationaire fase bereikt (OD > 3). De hoeveelheid en verdunt aan OD600nm rond 0,1-0,5. Voor typische experimenten, gebruik maken van drie onafhankelijke biologische repliceren culturen. Anhydrotetracycline (ATC), een tetracycline analoge inductor van verslaggever expressie (die wordt gecontroleerd door een tetracycline-afleidbaar promotor) tot een definitieve concentratie van 50 ng/mL. Om de effecten van kasugamycine op verkeerde vertaaltarieven21, voeg verschillende doses van kasugamycine aan de cultuur (Zie Figuur 4 voor de aangegeven doses) op hetzelfde moment (bij de geteste doses, kasugamycine heeft geen antimicrobiële activiteit). Merk op dat het belangrijk is om ten minste één niet-geïnduceerde controle voor elke reporter op te nemen. Cultuur-induceer culturen voor 4-6 h bij 37 °C met schudden. Breng de bacteriële culturen naar een 2 mL buis, en centrifuge op 3.220 x g voor 5 min bij kamertemperatuur om pellet vaststelling van de bacteriën. Verwijder de bovendrijvende. Verstoren van de bacteriën door toevoeging van 40 l van 1x passieve lysis buffer (geleverd door een Dual-Luciferase Kit), die is verdund (1:1) in dubbel gedestilleerd water. Breng de opnieuw opgehangen bacteriële lysate naar een witte 96-well plaat, een goed per monster, en schud bij kamertemperatuur voor 20 min.Let op: Niet over Incubeer de bacteriën in lysis buffer (voor meer dan 30 min). Voeg 80 l van Firefly substraat aan elk goed, schud voor 15 s, en meet de luminescentie door luminometer met 1.000 MS als integratietijd. Gebruik een geautomatiseerde injector of een multikanaals pipet om pipet fouten te voorkomen. Voeg 80 l van Renilla substraat toe aan elk goed, schud voor 15 s, en meet de luminescentie door luminometer met 1.000 MS als integratietijd. Aftrekken van de achtergrond luminescentie-gemeten met behulp van wild-type M. smegmatis (dwz, niet met verslaggevers) of onbewogen reporter lysate-van de gemeten waarden. Gebruik de gecorrigeerde waarden om de verkeerde omzettings percentages van elke voorwaarde te berekenen met behulp van de volgende vergelijking11,25, waarbij DN verwijst naar de activiteit in de gemuteerde reporter stam: 2. Nluc/GFP verslaggever Opmerking: Voor een visuele weergave van deze methode, Zie Figuur 3. Inoculeren de bacteriële reporter stam van-80 °C voorraad met 2 mL van 7H9 medium. Schud bij 37 °C voor 1 tot 2 dagen tot OD600 de stationaire fase bereikt (OD > 3). Subcultuur tot 50 mL 7H9 medium en groeien tot OD600 bereikt de late stationaire fase (> 4). Alvorens de bacteriën tot een 96-well plaat te geven, voeg ATC toe aan een eindconcentratie van 50 ng/mL en meng goed. De inductie van de bulk cultuur zorgt ervoor dat alle putten dezelfde hoeveelheid inductor bevatten en dat de inductie van de verslaggever gesynchroniseerd is. Hoeveelheid de bacteriën aan een duidelijke, ronde-bodem 96-goed plaat, met 100 l van volume in elk goed. Om voor kleine moleculen te screenen die verkeerde omzettings tarieven beïnvloeden, voeg de verbinding bij de vermelde concentratie toe om putten te selecteren. Voor de toepassing van dit protocol, gebruik kasugamycine (bij doses aangegeven in Figuur 5) als een illustratie. Voeg verschillende doses kasugamycine toe om putten te selecteren (elke experimentele groep moet ten minste twee biologische replicaties bevatten). Schud en induceer de monsters bij 37 °C voor 16-20 h.Opmerking: Het is noodzakelijk om de plaat met film te verzegelen. Ook moeten alle rand putten worden gevuld met ten minste 200 l steriel water om de verdamping van de test putten te beperken. Neem 80 l van elk goed, met behulp van een multichannel Pipet, en breng de monsters naar een zwarte 96-well plaat (die de fluorescentie signaal meting maximaliseert). Meet het GFP signaal door luminometer met 20 MS als integratietijd. Na het meten van het GFP signaal, centrifugeer de plaat bij 3.220 x g voor 10 min. Breng 50 l van de bovendrijvende naar een wit-bodem 96-well plaat (die de luminescentie signaal meting maximaliseert), voeg 50 l van Nluc substraat toe aan elk goed, meng ze goed, en meet de luminescentie door luminometer met 1.000 MS als integratietijd. Bepaal de Nluc/GFP verhouding door de gecorrigeerde Nluc luminescentie waarden door GFP fluorescentie te verdelen: deze maatregel (in willekeurige eenheden) is een relatieve maatregel van aspartaat voor Asparagine verkeerde vertaling.

Representative Results

Een cartoon illustreert de algemene schets van de twee reporter systemen gebruikt in dit werk zijn te zien in Figuur 1. Een overzicht van deel 1 van het protocol wordt weergegeven in Figuur 2 en een overzicht van punt 2 in Figuur 3. Het effect van kasugamycine op mycobacteriële verkeerde vertaling wordt weergegeven in Figuur 4, zoals gemeten door het Renilla-Firefly reporter systeem. Om de specificiteit van de kasugamycine actie te tonen, werd de verslaggever ook uitgedrukt in een stam van M. smegmatis waarin ksgA werd geschrapt (∆ ksgA). KsgA is een rRNA dimethyl transferase, en KsgA-verwijderde stammen zijn relatief resistent tegen kasugamycine. Kasugamycine actie op verkeerde vertaling werd ook gemeten met behulp van de Nluc/GFP Reporter, zoals weergegeven in Figuur 5. Figuur 1 : Cartoon illustreren de twee gain-of-functie reporter systemen. (A) de Renilla-Firefly reporter systeem bestaat uit twee Luciferase enzymen, uitgedrukt als een fusie-eiwit en onder de controle van een tetracycline-afleidbaar promotor. Expressie van het wild-type Dual enzym resulteert in een hoge meetbare activiteit van zowel Renilla en Firefly luciferases (top). Mutatie van een kritische aspartaat residu, D120, in Renilla te Asparagine Renders het RENILLA enzym (D120N) inactief, maar Firefly Luciferase is nog steeds actief. De verkeerde vertaling van Asparagine naar aspartaat (in dit geval, van fysiologisch misacylated ASP-tRNAASN tRNA5,21) resulteert in een klein deel van de vertaalde Renilla -eiwitten die activiteit verkrijgen, die kunnen worden gemeten. Vergelijking van de Renilla/Firefly activiteit van de gemuteerde verslaggever in vergelijking met de wild-type Dual enzyme maakt de berekening van de Asparagine tot een aspartaat misvertaling tarief. (B) het NLUC/GFP reporter systeem werkt op een soortgelijk principe. Het gemuteerde Nluc (D140N) gen heeft een N-Terminal afscheidings signaal afgeleid van antigen 85A, een belangrijke afgescheiden mycobacteriële proteïne. Zowel de nluc en GFP genen worden uitgedrukt uit identieke tetracycline-afleidbaar promotors, om het gebruik van GFP als een relatieve expressie benchmark. Let op het gebrek aan wild-type Nluc controlestam: deze verslaggever wordt voornamelijk gebruikt in de screening, waar metingen van de relatieve verkeerde vertaling tarieven voldoende zijn voor het primaire scherm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2 : Schets van het meten van de verkeerde vertaling tarief met behulp van Renilla-Firefly Reporter (deel 1 van het Protocol). De verse culturen van M. smegmatis, die met een plasmide worden omgezet die de dubbel-Luciferase verslaggevers uitdrukt, worden gekweekt. De verslaggever expressie wordt geïnduceerd, en onderzoek verbindingen of voorwaarden worden getest. Na 4-6 h van verslaggever expressie, de culturen zijn pelleted en lysed en de lysaten worden getest op Dual-Luciferase activiteit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3 : Schets van het meten van de verkeerde vertaling tarief Nluc-GFP verslaggever (deel 2 van het Protocol). Een nieuwe cultuur van M. smegmatis, getransformeerd met de NLUC en GFP reporters, is uitgegroeid tot een voldoende volume voor alle platen te testen (uitgaande van ~ 10 ml/96-well plaat). Onmiddellijk voorafgaand aan het pipetteren van de bacteriële cultuur in elk goed, induceren de expressie van de verslaggevers met ATC toegevoegd aan de bulk cultuur. Incubeer de putten door te schudden ze ‘s nachts. Voor het meten van de relatieve verkeerde vertaling tarieven, de overdracht van de culturen naar een zwarte plaat (om de gevoeligheid van de fluorescentie detectie te verhogen), meet de GFP fluorescentie, en dan, draai de platen naar beneden om pellet de bacteriën. Breng de bovendrijvende naar een witte plaat voor Nluc activiteit meting. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4 : Representatief resultaat van het gebruik van Renilla-Firefly verslaggever het meten van de verkeerde vertaling tarief in de aanwezigheid van kasugamycine in verschillende stammen. Misvertalings percentages van aspartaat voor Asparagine in (A) wild-type M. smegmatis en (B) een stam verwijderd voor ksgA (∆ ksgA) na behandeling met kasugamycine (KSG) zoals gemeten door de Renilla-Firefly Dual Verslaggever. De culturen werden behandeld met kasugamycine bij aangegeven doses (in microgram/milliliter) voor 6 uur voorafgaand aan de cel lysis en metingen. De gecorrigeerde ren/FF ratio’s (y-assen) zijn indicatief voor de aspartaat voor Asparagine verkeerde vertaaltarieven. De schrapping van ksgA resulteert in een hogere Baseline verkeerde vertaling tarief, dat is beter bestand tegen modulatie door kasugamycine. De staven wijzen op de gemiddelde waarden, met standaardafwijking als fout. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5 : Representatief resultaat van het gebruik van Nluc-GFP verslaggever het meten van de verkeerde vertaling tarief in de aanwezigheid van kasugamycine. Relatieve verkeerde omzettings percentages van aspartaat voor Asparagine in wild-type M. smegmatis zoals gemeten door de NLUC/GFP Reporter, na behandeling met kasugamycine (KSG) overnachting (16 uur). De staven wijzen op de gemiddelde waarden, met standaardafwijking als fout. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Het hier beschreven protocol kan worden aangepast voor de meting van de misvertalings tarieven in een breed scala van organismen. Er zijn een aantal overwegingen die in gedachten moeten worden gehouden bij de aanpassing van het protocol aan andere systemen. Ten eerste moet het doel van de meting worden overwogen. Voor de nauwkeurige meting van foutieve tarieven met behulp van gain-of-functie reporters, wat nodig is is (a) een robuuste uitlezing assay (bijvoorbeeld, enzymatische functie [in dit geval, Luciferase activiteit] met een breed lineair bereik). Ook, zoek naar (b) een verlies van functie Mutatie in een kritisch residu van de verslaggever eiwit dat resulteert in een zeer significant verlies van functie, onder het verwachte percentage van de verkeerde vertaling. Bijvoorbeeld, als de verwachte te meten misvertalings tarief ongeveer 10-3/codon is, moet het verlies van functieverandering groter zijn dan 1.000-vouwen; anders zal de lagere reeks van misvertaling gebeurtenissen niet gevoelig worden gedetecteerd. Ten slotte, voor de accurate meting van de verkeerde vertaling tarieven met behulp van gain-of-functie verslaggevers, (c) een robuuste benchmark reporter nodig is-in dit geval, Firefly Luciferase voor sectie 1 van het protocol. Idealiter moet de benchmark verslaggever worden gesmolten tot de gemuteerde enzymatische Reporter, het garanderen van (voor alle doeleinden) dat ze beide worden uitgedrukt in mengsel ratio’s. De benchmark (en primaire Reporter) uitlezing moet robuust zijn om verstoringen aan blootgestelde omgevingen. Bijvoorbeeld, de fluorescentie van wild-type GFP is zeer gevoelig voor verstoring door veranderingen in pH28, waardoor het ongeschikt als een benchmark voor de meting van de verkeerde vertaling tarieven in phagocytosed mycobacteriën in macrofagen, die wonen in phagosomes die lager zijn dan pH 729. Aan de andere kant, voor toepassingen zoals kleine molecule screening, de belangrijkste overwegingen voor een primair scherm zal de reproduceerbaarheid van de metingen (dat wil zeggen, precisie, in tegenstelling tot de nauwkeurigheid), de minimalisering van de handmatige behandeling, en kleine cultuur volumes. De nauwkeurige metingen van verkeerde omzettings tarieven zijn minder belangrijk en kunnen als secundaire analyses worden uitgevoerd. Ten slotte moet worden opgemerkt dat de verslaggevers beschreven in dit protocol, gebaseerd op de enzymatische functie van Luciferase enzymen, alleen zal meten gemiddelde verkeerde vertaling tarieven van een bacteriële populatie, maar kan geen informatie geven over eencellige heterogeniteit variatie in verkeerde vertaaltarieven. Gezien het belang van single-cell variabiliteit in adaptieve fenotypes30,31,32, fluorescerende verslaggevers voor de meting van de misvertaling gebeurtenissen zijn ontwikkeld12,33 , ook voor de meting van de verkeerde vertaling in mycobacteriën5.

Gelet op de eisen voor de meting van de verkeerde vertaling, moet worden opgemerkt dat de genetische gain-of-functie verslaggevers zoals beschreven in dit protocol kan slechts een soort van verkeerde vertaling (dat wil zeggen, een aminozuur substitutie te meten voor een codon) per verslaggever. Daarom, voor de meting van verschillende misvertaling gebeurtenissen, zijn meerdere verslaggevers nodig. Bijvoorbeeld, voor de meting van de verkeerde vertaling door ribosomale decodering fouten van near-cognate codon door lysyl-tRNA op een positie, ten minste 16 reporters zijn vereist2,3,11. De de massaspectrometrie en bioinformatica van de hoge precisie laten voor de potentiële identificatie van vele verschillende types van misvertalings gebeurtenissen gelijktijdig18toe; echter, deze methoden komen ook met voorbehoud. In het algemeen zijn ze minder nauwkeurig dan winst-van-functie verslaggevers. Bovendien, zoals eerder gezegd, zijn ze minder geschikt voor de opsporing van bepaalde vormen van misvertaling, namelijk die die kunnen worden opgeblazen met niet-enzymatische deamidie23. Tot slot is massaspectrometrie niet geschikt als uitlezing voor de middellange of hoge-throughput-screening.

Voor de aanpassing van deze verslaggevers en protocollen voor de meting van verkeerde vertaling in andere systemen, omvatten de verdere overwegingen een robuuste uitdrukking van de verslaggever in het gewenste modelsysteem. We hebben aanvankelijk geprobeerd om de Dual-Luciferase systeem ontwikkeld door Farabaugh en collega’s in onze mycobacteriële systeem te gebruiken zonder wijzigingen, maar had geen succes, als gevolg van een gebrek aan verslaggever expressie. Het uitgebreide oplossen van problemen identificeerde dat zowel codon-optimalisering als een minder belangrijke opeenvolgings wijziging van de verslaggevers om voor robuuste uitdrukking25 moesten toelaten (en zie hierboven). Het is denkbaar dat soortgelijke aanpassingen van de verslaggevers nodig zou zijn voor gebruik in andere systemen.

Ten slotte moet rekening worden gehouden met het type van de verkeerde vertaling evenement wordt gemeten. Bijvoorbeeld, als er behoefte is om te meten stop-codon readthrough (onzin onderdrukking), de stop codon verlies van functie Mutatie moet worden ingevoerd binnen een niet-kritieke regio van de primaire reporter proteïne34. Anders, alleen specifieke onzin onderdrukking gebeurtenissen die het kritieke residu (en dus verslaggever functie) te herwinnen zal worden gemeten door de Assay, die zou kunnen leiden tot een aanzienlijke onderschatting van de werkelijke verkeerde vertaling tarieven. Er is steeds meer bewijs dat translationele fout een mogelijke adaptieve rol speelt in een groot aantal organismen1,12,13,35. Echter, de meting van misvertaling gebeurtenissen is nog steeds beperkt tot een klein, zij het groeiend aantal modelsoorten. De aanpassing van gevoelige methoden om verkeerde vertaling te meten heeft het potentieel om het begrip van wetenschappers van de rol van vertaalfout in fysiologie en pathologie verder te verhogen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd deels ondersteund door subsidies van de Bill en Melinda Gates Foundation (OPP1109789), de National Natural Science Foundation of China (31570129), en start-up fondsen van de Tsinghua University School of Medicine aan BJ BJ is een welkom vertrouwen Onderzoeker (207487/Z/17/Z).

Materials

Middlebrook 7H9 BD Difco 271310
anhydrotetracycline Cayman Chemical  10009542
kasugamycin sigma K4013
Dual-luciferase reporter assay system promega E1960
Nano-Glo luciferase assay promega N1120
Fluoroskan Ascent FL luminometer Thermo /
Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid Costar 3922
Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid Costar 3925
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid Costar 3599
Non-commercial reagents (plasmids)
pUV-TetOR-RenFF NA NA episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter
pUV-TetOR-Ren-D120N-FF dual-luciferase reporter with mutated Renilla
pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N NA NA episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase
pMC1S-GFP NA NA Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B. Protein mistranslation: friend or foe. Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 355-362 (2014).
  2. Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase. Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).
  3. Manickam, N., Nag, N., Abbasi, A., Patel, K., Farabaugh, P. J. Studies of translational misreading in vivo show that the ribosome very efficiently discriminates against most potential errors. RNA. 20 (1), 9-15 (2014).
  4. Netzer, N., et al. Innate immune and chemically triggered oxidative stress modifies translational fidelity. Nature. 462 (7272), 522-526 (2009).
  5. Su, H. W., et al. The essential mycobacterial amidotransferase GatCAB is a modulator of specific translational fidelity. Nature Microbiology. 1 (11), 16147 (2016).
  6. Li, L., et al. Naturally occurring aminoacyl-tRNA synthetases editing-domain mutations that cause mistranslation in Mycoplasma parasites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9378-9383 (2011).
  7. Li, L., et al. Leucyl-tRNA synthetase editing domain functions as a molecular rheostat to control codon ambiguity in Mycoplasma pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3817-3822 (2013).
  8. Ling, J., Soll, D. Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4028-4033 (2010).
  9. Raina, M., et al. Reduced amino acid specificity of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is associated with elevated mistranslation of Tyr codons. Journal of Biological Chemistry. , (2014).
  10. Wu, J., Fan, Y., Ling, J. Mechanism of oxidant-induced mistranslation by threonyl-tRNA synthetase. Nucleic Acids Research. 42 (10), 6523-6531 (2014).
  11. Kramer, E. B., Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. RNA. 13 (1), 87-96 (2007).
  12. Evans, C. R., Fan, Y., Weiss, K., Ling, J. Errors during Gene Expression: Single-Cell Heterogeneity, Stress Resistance, and Microbe-Host Interactions. mBio. 9 (4), (2018).
  13. Mohler, K., Ibba, M. Translational fidelity and mistranslation in the cellular response to stress. Nature Microbiology. 2, 17117 (2017).
  14. Bullwinkle, T. J., et al. Oxidation of cellular amino acid pools leads to cytotoxic mistranslation of the genetic code. Elife. 3, (2014).
  15. Fan, Y., et al. Heterogeneity of Stop Codon Readthrough in Single Bacterial Cells and Implications for Population Fitness. Molecular Cell. 67 (5), 826-836 (2017).
  16. Fan, Y., et al. Protein mistranslation protects bacteria against oxidative stress. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1740-1748 (2015).
  17. Schwartz, M. H., Pan, T. Temperature dependent mistranslation in a hyperthermophile adapts proteins to lower temperatures. Nucleic Acids Research. 44 (1), 294-303 (2016).
  18. Schwartz, M. H., Waldbauer, J. R., Zhang, L., Pan, T. Global tRNA misacylation induced by anaerobiosis and antibiotic exposure broadly increases stress resistance in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. , (2016).
  19. Curnow, A. W., et al. Glu-tRNAGln amidotransferase: a novel heterotrimeric enzyme required for correct decoding of glutamine codons during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (22), 11819-11826 (1997).
  20. Rathnayake, U. M., Wood, W. N., Hendrickson, T. L. Indirect tRNA aminoacylation during accurate translation and phenotypic mistranslation. Current Opinion in Chemical Biology. 41, 114-122 (2017).
  21. Chaudhuri, S., et al. Kasugamycin potentiates rifampicin and limits emergence of resistance in Mycobacterium tuberculosis by specifically decreasing mycobacterial mistranslation. eLife. 7, (2018).
  22. Toosky, M., Javid, B. Novel diagnostics and therapeutics for drug-resistant tuberculosis. British Medical Bulletin. 110 (1), 129-140 (2014).
  23. Robinson, N. E., Robinson, A. B. Deamidation of human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12409-12413 (2001).
  24. Miura, S., et al. Urate oxidase is imported into peroxisomes recognizing the C-terminal SKL motif of proteins. European Journal of Biochemistry. 223 (1), 141-146 (1994).
  25. Javid, B., et al. Mycobacterial mistranslation is necessary and sufficient for rifampicin phenotypic resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 1132-1137 (2014).
  26. Wong, S. Y., et al. Functional role of methylation of G518 of the 16S rRNA 530 loop by GidB in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (12), 6311-6318 (2013).
  27. Wiker, H. G., Harboe, M. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis. Microbiological Reviews. 56 (4), 648-661 (1992).
  28. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6, 28166 (2016).
  29. Li, H., Wu, M., Shi, Y., Javid, B. Over-Expression of the Mycobacterial Trehalose-Phosphate Phosphatase OtsB2 Results in a Defect in Macrophage Phagocytosis Associated with Increased Mycobacterial-Macrophage Adhesion. Frontiers in Microbiology. 7, 1754 (2016).
  30. Aldridge, B. B., et al. Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility. Science. 335 (6064), 100-104 (2012).
  31. Rego, E. H., Audette, R. E., Rubin, E. J. Deletion of a mycobacterial divisome factor collapses single-cell phenotypic heterogeneity. Nature. 546 (7656), 153-157 (2017).
  32. Zhu, J. H., et al. Rifampicin can induce antibiotic tolerance in mycobacteria via paradoxical changes in rpoB transcription. Nature Communications. 9 (1), 4218 (2018).
  33. Lant, J. T., et al. Visualizing tRNA-dependent mistranslation in human cells. RNA Biology. 15 (4-5), 567-575 (2018).
  34. Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4 (4), 479-486 (1998).
  35. Melnikov, S. V., van den Elzen, A., Stevens, D. L., Thoreen, C. C., Soll, D. Loss of protein synthesis quality control in host-restricted organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).

Tags

MycobacteriumMistranslation RatesGain-of-function ReporterNluc/GFP AssayAntibiotic ToleranceProtein Synthesis Errors7H9 MediumOD 600ATCKsgPassive Lysis BufferFirefly SubstrateRenilla SubstrateLuminometer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chen, Y., Pan, M., Chen, Y., Javid, B. Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems. J. Vis. Exp. (146), e59453, doi:10.3791/59453 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image