Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

Yu-Xiang Chen; Miamiao Pan; Yue-Meng Chen; Babak Javid

doi:10.3791/59453

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Immunology and Infection

מדידה של שיעורי הטעויות הספציפיים של פטרת מערכות כתבת

Published: April 26, 2019

doi:

10.3791/59453

Yu-Xiang Chen¹, Miamiao Pan¹, Yue-Meng Chen¹, Babak Javid¹

¹Centre for Global Health and Infectious Diseases, Collaborative Innovation Centre for the Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases,Tsinghua University School of Medicine

Summary

במאמר זה, אנו מציגים שתי שיטות משלימות כדי למדוד שיעור ספציפי של שגיאה טרנסלבותית ו טעויות במודל הדגם, פטרת סמגטיס, באמצעות מערכות העיתונאי רווח. ניתן ליישם את השיטות כדי למדוד שיעורי שגיאה מדויקים בתפוקה נמוכה או בשיעורי שגיאה יחסיים בהגדרת תפוקה גבוהה יותר.

Abstract

התרגום של גנים לחלבונים הוא נוטה לשגיאות. למרות ששיעור השינוי הממוצע במערכות מודל מוערך כ-1/10000 לכל codon, שיעורי השגיאה בפועל משתנים באופן נרחב, בהתאם למין, לסביבה ולמחקר. בעבר הצגנו כי בקטריה משתמשים מסלול שני שלבים עבור הדור של גלוטמין אספרגין tRNAs והוא משויך במיוחד עם שיעורי שגיאה גבוהה יחסית עקב אפנון של שיעורי טעויות על ידי רכיב חיוני של השביל. שנינו מועסק בעבר Renilla-גחלילית מערכת כפולה לוציפראז שנעשה שימוש כדי למדוד שיעורי טעויות ב es, coli לשימוש ב פטרת למדוד שיעורי טעויות מסוימים של גלוטמט ב גלוטמין בעלי-מאספרגין. למרות שמערכת עיתונאי זו התאימה להערכה מדויקת של שיעורי שגיאה ספציפיים, חוסר רגישות ודרישות עבור שלבי מניפולציה מוגזמת הפכו אותו למתאים ליישומים בעלי תפוקה גבוהה. לכן, פיתחנו מערכת רווח השני של הפונקציה הכתב, באמצעות Nluc לוציפראז וחלבון פלורסנט ירוק (GFP), אשר קלה יותר להגדרות בינונית/תפוקה גבוהה. השתמשנו במערכת זו כדי לזהות את קגממיצין כמולקולה קטנה שיכולה להקטין את טעויות בקטריות. למרות הכתבים שאנו מתארים כאן השתמשו כדי למדוד סוגים ספציפיים של טעויות בקטריאלי, הם עשויים להיות שונה כדי למדוד סוגים אחרים של טעויות במספר מערכות מודל.

Introduction

זרימת המידע בביולוגיה מולקולרית דורשת תרגום של מידע גנטי לחלבונים פונקציונליים. כמו בכל מערכות ביולוגיות, תרגום גנטי כרוך גם שגיאות מדידה. הערכות של שיעורי השגיאה בתרגום מצוטטים בדרך כלל כ-1/10000 לכל קודון (ביקורת על ידי ribas דה pouפלנה ואח ‘¹). עם זאת, שיעורי השגיאה משתנים במידה רבה, מפחות מ^-10-5 ליותר מ-0.05/codon¹^,²^,³^,⁴^,⁵. מגוון רחב של שיעורי שגיאה, המשתרעים על פני יותר משלוש הזמנות של סדר גודל, נובע מהעובדה ששגיאות יכולות לנבוע ממספר שלבים במסלול התרגום: משגיאות סטוכסטיים, מודסות, או שגיאות במצבי מתח בעמינח של הספר⁶^, מיכל ^סבן ^, בן שמונה ^, מיכל בן ¹⁰ ^, ¹⁰, שגיאות פיזיולוגיות של asparaginyl-ו-glutaminyl-trnas⁵, או מפענח הריבוזומיום²^,³^,¹¹. שיעורי שגיאה גבוהים למדי, המייצגים מעל 0.01/codon, הציע שגיאות טרנסלtional עשויות לבצע פונקציות פיזיולוגיות¹^,¹² וכי טעויות עשוי להיות ספציפי להקשר¹³.

אנחנו ואחרים הראו כי באופן טבעי שגיאות בתרגום גנטי עשוי להיות מותאם, במיוחד במהלך הלחץ הסביבתי¹^,⁵^,¹²,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶ ^,¹⁷^,¹⁸. ב פטרת, שגיאות שנוצרו על ידי שני צעד עקיף גלוטמין/אספרגין trna עמינח מסלול¹⁹^,²⁰ התוצאה רגישות מוגברת להפליא עבור אנטיביוטיקה השורה הראשונה antituberculosis גריסופלובין ⁵. לכן, אנו העריכו כי הפחתת טעויות בקטריאליים עם מולקולה קטנה עשויה להיות פוטנציאל להרוג על ידי גריסופלובין. הוקרנו וזיהינו את החומר הטבעי המגליציאני בצורה טבעית, כתרכובת שעלולה להקטין את הטעויות החיידקים, מסוגל להרוג גריסופלובין-בתיווך הריגת בקטריות הן במבחנה והן בvivo^-21, ולהגביל את ה הופעתה של גריסופלובין ההתנגדות²¹, אשר מאיימת על השליטה הגלובלית של שחפת²² -הפתוגן הקטלני ביותר בעולם.

כדי ללמוד שגיאה טרנסלבותית, שיטות למדידה של טעויות צריך להיות מועסק. ישנן מספר שיטות שפותחו למדידת טעויות, כל אחד עם יתרונות וחסרונות. בקצרה, שיטות מבוססות מאוד על המסה מבוססת על מספר יתרונות, החשובה ביותר היא כי עם אלגוריתמים חדשים יותר לאיתור סוגים מרובים של שגיאה translational, מדידה משוחדת יחסית של טעויות יכול להיות שבוצעה¹⁸. עם זאת, הספקטרומטר ההמוני אינו מתאים מאוד למדידה של טעויות אירועים בלתי-הולמים – בדיוק סוג הטעויות המתרחש בחיידק הנובע ממסלול הדרך העקיף של tRNA עמינח שגיאות. הסיבה לכך היא בתדירות גבוהה ובלתי אנזימטית, המתרחשת בעיבוד דגימות עבור ספקטרומטר המסה²³, והתוצאה היא אות ברקע גבוה במיוחד. לכן, לאיתור שגיאות בנתיב זה, הרווח הגנטי כתבים הפונקציה מציעים יתרונות שונים. באופן ספציפי, כתבים בעלי תפקוד מתאים יכולים להיות בעלי שיעורי רקע נמוכים במיוחד, המאפשרים את המדידה של שיעורי שגיאה נמוכים מאוד¹¹.

מאז ביצוע ניסויים עם השחפת הפתוגניים שחפת דורש מתקנים מיוחדים ואמצעי זהירות נוספים, אנו מבצעים את רוב הניסויים בפטרת שאינו פתוגניים M. סמיגטיס — והראו מוקדם יותר כי התוצאות בין שני המינים הן בהיקף רחב של⁵^,²¹. כדי למדוד שיעורי טעויות בתוך פטרת שנוצר על ידי מסלול בלתי ישיר tRNA עמינח, שינו מערכת Renilla-גחלילית כפולה שפותחה בעבר כדי למדוד שגיאות פענוח הריבוזומבית E. coli ¹¹ לשימוש בפטרת. עשינו שלושה שינויים ספציפיים: הכתב המקורי לא הביע ביעילות בפטרת, ולכן, הרצף היה ממוטב מאוד, ואת C-טרמינל שלוש חומצות אמינו של לוציט גחלילית, סרין-ליזין-leucine, אשר כבר מסומן כאות סחר בכמה מערכות²⁴, שונה ל isoleucine-אלנין-valine²⁵. לכתב המקורי היה שאריות ליזין קריטיים במקום זאת, אנו מוטציה או שמרו באופן ביקורתי (D120) או גלוטמט (E144) שאריות ב Renilla לוציפראז כדי אספרגין ו גלוטמין, בהתאמה²⁵ (איור 1). העיתונאי היה משוכפל טטרציקלין האפיזומאין-inducible באמצע pUV-tetOR (לראות את הטבלה של חומרים). כתבים בעלי תפקוד מוטציה שמרו באופן ביקורתי על משקעים פונקציונליים בפרוטאינים של אנזימים/פלורסנט המעבדת אותם באופן שאינו פונקציונלי¹¹^,²⁶. טרנסלליזם (או תיאורטית, באופן תיאורטי) שגיאות לסנתז את הגרסה הפונקציונלית של החלבון יגרום לפעילות אנזימים מדידה בקבוצת משנה של חלבונים מתורגמים. כדי לתקן את הווריאציה בשפע החלבון, הכתב המוטציה מבוטא בחלבון פונקציונלי הפועל בתור בחינת ביצועים ומאפשר כימות מדויקת של רווח של הפונקציה¹¹. בעוד renilla-גחלילית כתב כפול לוציפראז מותר עבור מדידה מדויקת של שיעורי טעויות מסוימים מפטרת מסוים⁵^,²⁵ (איור 2 וסעיף 1 של הפרוטוקול), אנחנו מהר הבינו כי הוא אינו מתאים הקרנת בינונית/תפוקה גבוהה של מולקולות שישנה את קצב טעויות. זה נובע בעיקר שתי סיבות, כלומר, א ‘ העדר היחסי של העוצמה של Renilla לוציפראז התכוון כי מינימום של 1 מ ל של התרבות הפטרת/מדגם נדרש כדי למדוד שיעורי טעויות, ו b) הדרישה לפירוק התאים לפני למדידת פעילות האנזים נדרש טיפול ידני מוגזם: בתאי פטרת יש קיר עבה, רב שכבתית תא ומעטפה כי הוא עמיד יחסית לליזה. לכן, חיפשנו לפתח מערכת חדשה של העיתונאי הרווח, כי ניתן להשתמש עם כרכים קטנים (למשל, במערכת 96-הצלחת לוחית) ולא היתה צורך בפירוק תאים עבור מדידות. השתמשנו החזק ביותר nluc ללוציפראז וזיהה שאריות aspart קריטי כי, כאשר מוטציה אספרגין, הביא 2 יומני הפסד של פונקציה (איור 1). יתר על כן, גודל קטן של Nluc איפשר לו להיות מסוף N-טרמינל תג אות — מן אנטיגן 85 a, האנטיגן הגדול המופרש ב-פטרת בקטריה²⁷ -זה יאפשר nluc להיות מופרש לתוך התרבות supernatant ולעקוף את הדרישה פירוק תאים. חלבון בחינת ביצועים, GFP, התבטא מיזם אותו כמו Nluc מוטציה, אבל מתוך וקטור משולב (לראות את הטבלה של חומרים), וניתן למדוד בתאים שלמים²¹ (איור 3). למרות יתרונות אלה, הכתב Nluc/GFP (סעיף 2 של הפרוטוקול) יש גם חסרונות: הפחתת צנוע יחסית בפעילות Nluc (100-קיפול) עם D140N מוטציה לא לאפשר את המדידה של שיעורי טעויות נמוך ביותר, הפיכת העיתונאי למתאים יותר ככלי הקרנה מאשר למדידות המדויקות של שגיאת הטרנסלבותית. יתר על כן, Nluc אין שאריות גלוטמט קריטי; לכן, ניתן למדוד רק שיעורי שגיאה אספרגין-to-aspartate. העקרונות הכלליים המתוארים בעבודה זו צריכים לאפשר לחוקרים להשתמש בכתבים האלה כפי שעשינו או לשנות כתבים בהתאם למדידה מדויקת ו/או מדידה של שיעורי שגיאה ספציפיים אחרים בשיטת המודל של רירה.

Protocol

1. רנלה-גחלילית כפולה לוציפראז כתב הערה: לקבלת ייצוג חזותי של שיטה זו, ראה איור 2. אינוייחסן העיתונאי מפטרת זנים מ-80 מלאי ° c עם 2 מ ל של 7H9 בינוני. פראי סוג הלוציפראז כפול, כמו גם Renilla מוטציה (עיתונאי) זנים, צריך לשמש כדי לאפשר את החישוב של שיעורי טעויות (ראה שלב 1.7). ללחוץ על 37 ° c עבור 1 עד 2 ימים עד OD600 מגיע השלב הנייח (OD > 3). הורדה ולדלל כדי OD600nm סביב 0.1-0.5. עבור ניסויים טיפוסיים, השתמש בשלוש תרבויות עצמאיות של שכפול ביולוגי. Anhydrotetracycline (האווירית), טטרציקלין אנלוגי של ביטוי הכתב (אשר נשלט על ידי inducible מיזם טטרציקלין) לריכוז הסופי של 50 ng/mL. כדי למדוד את ההשפעות של קסוגממיצין על טעויות שיעורי21, להוסיף מינונים שונים של קסוגממיצין לתרבות (ראה איור 4 עבור מינונים המצוין) באותו זמן (במינון נבדק, קסוגממיצין אין פעילות מיקרוביאלית). שים לב שחשוב לכלול לפחות פקד אחד שאינו מושרה עבור כל עיתונאי. תרביות לגרום לתרבות עבור 4-6 h ב 37 ° צ’ עם רעד. להעביר את התרבויות החיידקי לצינור 2 מ”ל, ו צנטריפוגה ב 3,220 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להוריד את החיידקים. . מחק את הסופרנטאנט לשבש את החיידקים על ידי הוספת 40 μL של 1x מאגר לפירוק פסיבי (שסופקו על ידי ערכת כפולה לוציפראז), אשר כבר מדולל (1:1) מים כפולים מזוקקים. העבר את החיידק מושעה מחדש ללוח 96 לבן-באר, אחד טוב לכל מדגם, ולנענע בטמפרטורת החדר עבור 20 דקות.זהירות: אין להתגבר על החיידקים במאגר הליזה (במשך יותר מ -30 דקות). הוסף 80 μL של המצע גחלילית לכל טוב, לנער עבור 15 s, ולמדוד את האור על ידי לומימטר עם 1,000 ms כמו זמן אינטגרציה. השתמש או מזרק אוטומטי או בפיפטה רב ערוצי כדי למנוע שגיאות ליטוף. הוסף 80 μL של המצע Renilla לכל טוב, לנער עבור 15 s, ולמדוד את האור על ידי לומימטר עם 1,000 ms כמו זמן אינטגרציה. הפחת את מאור הרקע שנמדד באמצעות מסוג M. סמיגטיס (כלומר, לא מכיל כתבים) או כתב לא מושרה-מהערכים הנמדדים. השתמש בערכים המתוקנים כדי לחשב את התעריפים הטעויות של כל תנאי באמצעות המשוואה הבאה11,25, כאשר DN מתייחסת לפעילות במאמץ העיתונאי המוטציה: 2. nluc/כתבת GFP הערה: לקבלת ייצוג חזותי של שיטה זו, ראה איור 3. איחסן העיתונאי החיידקי להתאמץ מ-80 מלאי ° c עם 2 מ ל של 7H9 בינוני. ללחוץ על 37 ° c עבור 1 עד 2 ימים עד OD600 מגיע השלב הנייח (OD > 3). תת-תרבות ל 50 mL של 7H9 בינונית ולגדול עד OD600 מגיע לשלב מאוחר נייח (> 4). לפני שאתה מצטט את החיידקים לצלחת 96-באר, להוסיף האווירית בריכוז סופי של 50 ng/mL ומערבבים היטב. אינדוקציה של התרבות הגורפת מבטיח כי כל הבארות מכילים את אותה כמות של אינדוקציה וכי האינדוקציה של העיתונאי מסונכרן. מחלק את החיידקים כדי ברור, התחתית עגול 96-צלחת, עם 100 μL של נפח בכל טוב. על המסך עבור מולקולות קטנות המשפיעים על שיעורי טעויות, להוסיף את המתחם על הריכוז המצוין כדי לבחור בארות. למטרות פרוטוקול זה, השתמש בקסוגממיצין (במינונים המצוינים באיור 5) כאיור. הוסף מינונים שונים של קסוגממיצין כדי לבחור בארות (כל קבוצה ניסיונית צריכה להכיל לפחות שני משכפל ביולוגי). לנער ולזרז את הדגימות ב 37 ° c עבור 16-20 h.הערה: יש צורך לאטום את הצלחת בסרט. כמו כן, כל הבארות קצה צריך להתמלא לפחות 200 μL של מים סטריליים כדי להגביל את האידוי מבארות הבדיקה. לקחת 80 μL מכל באר, באמצעות הפיפטה רב ערוצי, ולהעביר את הדגימות לצלחת שחור 96-באר (אשר מגדיל את מדידת אות הזריחה). מדוד את אות ה-GFP באמצעות לומימטר עם 20 אלפיות הזמן לאינטגרציה. לאחר מדידת האות GFP, צנטריפוגה את הצלחת ב 3,220 x g עבור 10 דקות. העברה 50 μl של supernatant ללבן תחתית 96-צלחת הבאר (אשר מגדיל את מדידת אות האור), להוסיף 50 μl של המצע nluc כל טוב, לערבב אותם היטב, ולמדוד את האור על ידי לומילומטר עם 1,000 ms כמו זמן אינטגרציה. קבע את היחס nluc/gfp על-ידי חלוקת ערכי האור הרגילים של nluc על-ידי הקרינה הפלואורסצנטית מתוקנת: מידה זו (ביחידות שרירותיות) היא מדד יחסי של אספרטט עבור אספרגין טעויות.

Representative Results

קריקטורה המדגימה את המתאר הכללי של שתי מערכות העיתונאי המשמשות בעבודה זו מוצגות באיור 1. מבט כולל על סעיף 1 של הפרוטוקול מוצג באיור 2 ומבט כולל על סעיף 2 באיור 3. ההשפעה של קסוגממיצין על טעויות בקטריאלי מוצג באיור 4, כפי שנמדד על ידי מערכת הכתבת renilla-גחלילית. כדי להראות את הספציפיות של הפעולה של קאסגממיצין, העיתונאי גם התבטא בנבג של מ. סמגטיס שבהם נמחק ksga (∆ ksga). Ksga הוא מעביר דימתיל תיל, ו- ksgaשנמחקו זנים הם עמידים יחסית כדי קסוגממיצין. הפעולה של קסוגממיצין ב-טעויות נמדדה גם באמצעות כתב Nluc/GFP, כפי שמוצג באיור 5. איור 1 : הקריקטורה המדגימה את שתי מערכות העיתונאי הרווח. (א) המערכת העיתונאית renillaמורכבת משני אנזימים לוציפראז הביע חלבון היתוך תחת שליטה של מקדם טטרציקלין-inducible. ביטוי של האנזים כפול מסוג פראי תוצאות פעילות מדידה גבוהה של Renilla ו גחלילית לוציי (למעלה). מוטציה של שאריות אספרטט קריטי, D120, ב renilla כדי אספרגין מעבד את האנזים renilla (D120N) לא פעיל, אבל לוציו גחלילית עדיין פעיל. טעויות של אספרגין לאספרטט (במקרה זה, מבחינה פיזיולוגית, Asp-trnaAsn trna5,21) תוצאות חלק קטן של החלבונים renilla מתורגמת צובר פעילות, שניתן למדוד. השוואה של הפעילות Renilla/גחלילית של הכתב מוטציה לעומת האנזים כפול מסוג פראי מאפשר את החישוב של אספרגין טעויות rate. (ב) מערכת הכתב NLUC/gfp פועלת בעיקרון דומה. המוטציה Nluc (D140N) גן יש אות N מסוף הפרשת נגזר אנטיגן 85 a, חלבון מופרש הגדול המפריש. הן nluc ו- gfp גנים מבוטא טטרציקלין זהה-inducible היזמים, כדי לאפשר את השימוש ב-gfp כמו ביטוי יחסי ביצועים. שימו לב להיעדר זן פראי בקרת Nluc: עיתונאי זה משמש בעיקר בהקרנה, שם מדידות של שיעורי טעויות יחסיים מספיקים עבור המסך הראשי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2 : חלוקה לרמות של מדידת שיעור טעויות באמצעות renilla-גחלילית כתב (סעיף 1 של הפרוטוקול). תרבויות טריות של מ. סמגטיס, שהפכו בעזרת פלסטלינה המבטאת את הכתבים הלוציתיים הכפולים, גדלו. הביטוי העיתונאי הוא המושרה, ותרכובות לבדיקה או תנאים נבדקים. בעקבות 4-6 h של ביטוי העיתונאי, התרבויות הם מחורץ ולאחר והליצטים נבדקים לפעילות לוציפראז כפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3 : חלוקה לרמות של מדידת הטעויות שיעור Nluc-GFP (סעיף 2 של הפרוטוקול). תרבות טרייה של מ. סמגטיס, הפכה עם הכתבים nluc ו-gfp, גדל לנפח מספיק עבור כל הלוחות כדי להיבדק (בהנחה ~ 10 מ”ל/96-באר צלחת). מיד לפני ללטף את התרבות החיידקית לתוך כל באר, לגרום לביטוי של הכתבים עם הפיקוח האווירית הוסיף לתרבות הגורפת. מודדים את הבארות. ע י ניעור הלילה כדי למדוד את התעריפים טעויות יחסיים, להעביר את התרבויות ללוח שחור (כדי להגביר את הרגישות של גילוי הזריחה), למדוד את הזריחה GFP, ולאחר מכן, לסובב את לוחיות למטה כדי להוריד את החיידקים. העבר את הסופרנטנט לצלחת לבנה עבור מדידת פעילות Nluc. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4 : תוצאת הנציג של שימוש renillaכתבת גחלילית מדידת קצב טעויות בנוכחות של קסוגמצין בזנים שונים. שערי טעויות של אספרטט עבור אספרגין ב(א) מסוג פראי M. סמיגטיס ו (ב) זן נמחק עבור ksga (∆ ksga) בעקבות הטיפול עם קסוגממיצין (ksga) כפי שנמדד על ידי renilla-גחלילית כפולה כתב. התרבויות טופלו עם קגממיצין במינונים מצוין (במיקרוגרמות/מיליליטר) עבור 6 h לפני הליזה תאים ומדידות. יחסי ה-Ren/FF המתוקן (ציר y) מצביעים על הaspart עבור תעריפי אספרגין טעויות. מחיקת ה- Ksga גורמת לקצב טעויות בסיסי גבוה יותר, שהוא עמיד יותר לאפנון על-ידי קסוגממיצין. הסרגלים מציינים את הערכים הרעים, עם סטיית תקן כשגיאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5 : תוצאת הנציג של שימוש בכתב Nluc-GFP מדידת קצב טעויות בנוכחות של קסוגממיצין. שיעורי הטעויות יחסיים של אספרטט עבור אספרגין בטבע מסוג M. סמיגטיס כפי שנמדד על ידי כתב nluc/gfp, לאחר הטיפול עם קסוגממיצין (ksg) לילה (16 h). הסרגלים מציינים את הערכים הרעים, עם סטיית תקן כשגיאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מותאם למדידה של שיעורי טעויות במגוון רחב של אורגניזמים. יש מספר שיקולים שיש לזכור בעת התאמת הפרוטוקול למערכות אחרות. ראשית, יש לשקול את מטרת המדידה. עבור המדידה המדויקת של התעריפים הטעויות באמצעות כתבים של הגברה, מה שנדרש הוא (א) שיטת בדיקה איתנה (לדוגמה, פונקציה אנזימטית [במקרה זה, פעילות לוציפראז] עם טווח ליניארי רחב). כמו כן, לחפש (ב) אובדן של מוטציה פונקציה בשאריות קריטי של חלבון העיתונאי שתוצאתו אובדן משמעותי מאוד של הפונקציה, מתחת לקצב הצפוי של טעויות. לדוגמה, אם קצב הטעויות הצפוי נמדד כ^-10-3/codon, ההפסד של מוטציה בפונקציה צריך להיות גדול מ-1,000-קיפול; אחרת, הטווח התחתון של אירועים טעויות לא יזוהה ברגישות. לבסוף, עבור המדידה המדויקת של התעריפים טעויות באמצעות כתבים הרווח לתפקד, (ג) כתבת בחינת ביצועים חזקה – במקרה זה, גחלילית ללוציפראז עבור סעיף 1 של הפרוטוקול. באופן אידיאלי, כתב בחינת ביצועים צריך להיות מחובר לכתב האנזימטי המוטציה, המבטיח (לכל הדעות והמטרות) ששניהם מבוטאים ביחס שווה. הבדיקה (והעיתונאי הראשי) צריכה להיות איתנה כדי לרטבאליות לסביבות חשופות. לדוגמה, הזריחה של מסוג פראי gfp הוא רגיש מאוד הפרטורציה על ידי שינויים ב-pH²⁸, מה שהופך אותו בלתי מתאים בחינת ביצוע עבור המדידה של שיעורי טעויות בחיידקים phagocytosed ב מקרופאגים, אשר מתגוררים ב phagosomes כי הם מתחת pH 7²⁹. מצד שני, עבור יישומים כגון הקרנת מולקולה קטנה, השיקולים החשובים ביותר עבור המסך הראשי יהיה השגות של המידות (כלומר, דיוק, בניגוד לדיוק), מזעור של טיפול ידני, קטן כרכים לתרבות. המידות המדויקות של התעריפים הטעויות הינן פחות חשובות וניתן לבצעו כתנאי משני. לבסוף, יש לציין כי הכתבים המתוארים בפרוטוקול זה, מבוסס על תפקוד אנזימטי של אנזימים לוציפראז, רק למדוד ממוצע שיעורי טעויות של אוכלוסייה חיידקית, אבל לא יכול לתת מידע על תא יחיד טרוגניות וריאציה בקצבי טעויות. בהתחשב בחשיבות של השתנות תא בודד ב פנוטיפים גמישים³⁰^,³¹^,³², כתבים פלורסנט למדידה של אירועים טעויות פותחו¹²^,³³, כולל עבור מדידה של טעויות ב בפטרת⁵.

לאחר שנחשב את הדרישות למדידה של טעויות, יש לציין כי הכתבים הגנטי של הפונקציה כמתואר בפרוטוקול זה יכול רק למדוד סוג אחד של טעויות (כלומר, אחד החלפת חומצת אמינו עבור אחד codon) לכל עיתונאי. לכן, למדידה של אירועים טעויות שונים, נדרשים כתבים מרובים. לדוגמה, עבור המדידה של טעויות על ידי שגיאות פענוח הריבוזומבית של כמעט cognate coדונים על ידי lysyl-trna בתנוחה אחת, לפחות 16 כתבים נדרשים²^,³^,¹¹. הספקטרומטר מסה בדיוק גבוה וביואינפורמטיקה מאפשרים זיהוי פוטנציאלי של סוגים שונים של אירועים טעויות בו¹⁸; עם זאת, שיטות אלה מגיעות גם עם אזהרות. באופן כללי, הם פחות מדויקים מאשר כתבים של הזכות לתפקד. יתר על כן, כפי שצוין קודם לכן, הם מתאימים פחות לאיתור סוגים מסוימים של טעויות, כלומר אלה שיכולים להיות מואבקים עם חוסר אנזימטיות של²³. לבסוף, הספקטרומטר המסה אינו מתאים לקריאה עבור הקרנת בינונית או תפוקה גבוהה.

להתאמת כתבים ופרוטוקולים אלה למדידת טעויות במערכות אחרות, שיקולים נוספים כוללים ביטוי חזק של העיתונאי במערכת המודל הרצויה. בתחילה ניסינו להשתמש כפול לוציפראז מערכת שפותחה על ידי Farabaugh עמיתים ועמיתיו במערכת שלנו מפטרת ללא שינויים אבל לא היה הצלחה, בשל חוסר הביטוי כתב. פתרון בעיות נרחב המזוהה כי הן מיטוב והן שינוי רצף מזערי של הכתבים נדרשו כדי לאפשר ביטוי חזק²⁵ (וראה לעיל). הדבר מתקבל על העובדה שעיבודים דומים של הכתבים יידרשו לשימוש במערכות אחרות.

לבסוף, יש להעניק שיקול לסוג האירוע הטעויות שנמדד. לדוגמה, אם יש צורך למדוד לעצור-codon קריאה (הדיכוי שטויות), הפסד של codon להפסיק של מוטציה פונקציה צריך להיות הציג בתוך אזור לא קריטי של הכתב הראשי חלבון³⁴. אחרת, רק אירועים מסוימים של דיכוי שטויות שקיבלו מחדש את השאריות הקריטיות (ומכאן, הפונקציה העיתונאית) נמדדת על ידי האפשרות, אשר עלולה להוביל להערכה משמעותית של התעריפים הטעויות האמיתיים. יש הוכחה גוברת כי שגיאה טרנסלבותית משחק תפקיד אדפטיבית אפשרי במספר רב של אורגניזמים¹^,¹²^,¹³^,³⁵. עם זאת, המדידה של אירועים טעויות הוא עדיין מוגבל למספר קטן, אם כי גדל של מינים מודל. הסתגלות של שיטות רגישות למדוד טעויות יש את הפוטנציאל להגדיל עוד יותר את ההבנה של המדענים של התפקיד של שגיאת תרגום בפיזיולוגיה ופתולוגיה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו היתה בחלק נתמך על ידי מענקים מקרן ביל ומלינדה גייטס (OPP1109789), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31570129), והתחל כספים מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת Tsinghua כדי ג’יי ג’יי הוא אמון ברוכים ה חוקר (207487/Z/17/ז).

Materials

Middlebrook 7H9	BD Difco	271310
anhydrotetracycline	Cayman Chemical	10009542
kasugamycin	sigma	K4013
Dual-luciferase reporter assay system	promega	E1960
Nano-Glo luciferase assay	promega	N1120
Fluoroskan Ascent FL luminometer	Thermo	/
Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid	Costar	3922
Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid	Costar	3925
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid	Costar	3599

Non-commercial reagents (plasmids)
pUV-TetOR-RenFF	NA	NA	episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter
pUV-TetOR-Ren-D120N-FF			dual-luciferase reporter with mutated Renilla
pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N	NA	NA	episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase
pMC1S-GFP	NA	NA	Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP

References

Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B. Protein mistranslation: friend or foe. Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 355-362 (2014).
Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase. Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).
Manickam, N., Nag, N., Abbasi, A., Patel, K., Farabaugh, P. J. Studies of translational misreading in vivo show that the ribosome very efficiently discriminates against most potential errors. RNA. 20 (1), 9-15 (2014).
Netzer, N., et al. Innate immune and chemically triggered oxidative stress modifies translational fidelity. Nature. 462 (7272), 522-526 (2009).
Su, H. W., et al. The essential mycobacterial amidotransferase GatCAB is a modulator of specific translational fidelity. Nature Microbiology. 1 (11), 16147 (2016).
Li, L., et al. Naturally occurring aminoacyl-tRNA synthetases editing-domain mutations that cause mistranslation in Mycoplasma parasites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9378-9383 (2011).
Li, L., et al. Leucyl-tRNA synthetase editing domain functions as a molecular rheostat to control codon ambiguity in Mycoplasma pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3817-3822 (2013).
Ling, J., Soll, D. Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4028-4033 (2010).
Raina, M., et al. Reduced amino acid specificity of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is associated with elevated mistranslation of Tyr codons. Journal of Biological Chemistry. , (2014).
Wu, J., Fan, Y., Ling, J. Mechanism of oxidant-induced mistranslation by threonyl-tRNA synthetase. Nucleic Acids Research. 42 (10), 6523-6531 (2014).
Kramer, E. B., Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. RNA. 13 (1), 87-96 (2007).
Evans, C. R., Fan, Y., Weiss, K., Ling, J. Errors during Gene Expression: Single-Cell Heterogeneity, Stress Resistance, and Microbe-Host Interactions. mBio. 9 (4), (2018).
Mohler, K., Ibba, M. Translational fidelity and mistranslation in the cellular response to stress. Nature Microbiology. 2, 17117 (2017).
Bullwinkle, T. J., et al. Oxidation of cellular amino acid pools leads to cytotoxic mistranslation of the genetic code. Elife. 3, (2014).
Fan, Y., et al. Heterogeneity of Stop Codon Readthrough in Single Bacterial Cells and Implications for Population Fitness. Molecular Cell. 67 (5), 826-836 (2017).
Fan, Y., et al. Protein mistranslation protects bacteria against oxidative stress. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1740-1748 (2015).
Schwartz, M. H., Pan, T. Temperature dependent mistranslation in a hyperthermophile adapts proteins to lower temperatures. Nucleic Acids Research. 44 (1), 294-303 (2016).
Schwartz, M. H., Waldbauer, J. R., Zhang, L., Pan, T. Global tRNA misacylation induced by anaerobiosis and antibiotic exposure broadly increases stress resistance in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. , (2016).
Curnow, A. W., et al. Glu-tRNAGln amidotransferase: a novel heterotrimeric enzyme required for correct decoding of glutamine codons during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (22), 11819-11826 (1997).
Rathnayake, U. M., Wood, W. N., Hendrickson, T. L. Indirect tRNA aminoacylation during accurate translation and phenotypic mistranslation. Current Opinion in Chemical Biology. 41, 114-122 (2017).
Chaudhuri, S., et al. Kasugamycin potentiates rifampicin and limits emergence of resistance in Mycobacterium tuberculosis by specifically decreasing mycobacterial mistranslation. eLife. 7, (2018).
Toosky, M., Javid, B. Novel diagnostics and therapeutics for drug-resistant tuberculosis. British Medical Bulletin. 110 (1), 129-140 (2014).
Robinson, N. E., Robinson, A. B. Deamidation of human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12409-12413 (2001).
Miura, S., et al. Urate oxidase is imported into peroxisomes recognizing the C-terminal SKL motif of proteins. European Journal of Biochemistry. 223 (1), 141-146 (1994).
Javid, B., et al. Mycobacterial mistranslation is necessary and sufficient for rifampicin phenotypic resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 1132-1137 (2014).
Wong, S. Y., et al. Functional role of methylation of G518 of the 16S rRNA 530 loop by GidB in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (12), 6311-6318 (2013).
Wiker, H. G., Harboe, M. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis. Microbiological Reviews. 56 (4), 648-661 (1992).
Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6, 28166 (2016).
Li, H., Wu, M., Shi, Y., Javid, B. Over-Expression of the Mycobacterial Trehalose-Phosphate Phosphatase OtsB2 Results in a Defect in Macrophage Phagocytosis Associated with Increased Mycobacterial-Macrophage Adhesion. Frontiers in Microbiology. 7, 1754 (2016).
Aldridge, B. B., et al. Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility. Science. 335 (6064), 100-104 (2012).
Rego, E. H., Audette, R. E., Rubin, E. J. Deletion of a mycobacterial divisome factor collapses single-cell phenotypic heterogeneity. Nature. 546 (7656), 153-157 (2017).
Zhu, J. H., et al. Rifampicin can induce antibiotic tolerance in mycobacteria via paradoxical changes in rpoB transcription. Nature Communications. 9 (1), 4218 (2018).
Lant, J. T., et al. Visualizing tRNA-dependent mistranslation in human cells. RNA Biology. 15 (4-5), 567-575 (2018).
Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4 (4), 479-486 (1998).
Melnikov, S. V., van den Elzen, A., Stevens, D. L., Thoreen, C. C., Soll, D. Loss of protein synthesis quality control in host-restricted organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Chen, Y., Pan, M., Chen, Y., Javid, B. Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems. J. Vis. Exp. (146), e59453, doi:10.3791/59453 (2019).

Automatically Generated

מדידה של שיעורי הטעויות הספציפיים של פטרת מערכות כתבת

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

Automatically Generated

מדידה של שיעורי הטעויות הספציפיים של פטרת מערכות כתבת

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below