Хромогенные На ситу Гибридизация SS инструмент для ВПЧ связанных головы и шеи диагностики рака
Summary
Вирус папилломы человека (ВПЧ) РНК-хромогенная на месте гибридизация считается одним из золотых стандартов для активного обнаружения папилломавируса вируса человека в опухолях. Это позволяет визуализировать экспрессию ВПЧ E6-E7 mRNA с локализацией и полуколичественной оценкой его сигнала.
Abstract
Инфекция папилломавируса человека (ВПЧ) является основным фактором риска для подтипа ортоглянского плоскоклеточного карциномы (OPSCC), который, как правило, связан с лучшим результатом, чем алкоголь и табак, связанных OPSCC. Хромогенная на месте гибридизация (CISH) вирусной РНК ВПЧ может позволить полуколичественную оценку вирусных транскриптов онкогенных белков E6 и E7 и визуализацию на месте с хорошим пространственным разрешением. Этот метод позволяет диагностировать активную инфекцию с визуализацией транскрипции ВПЧ в опухолевых ВПЧ-инфицированных клетках. Преимуществом этого метода является предотвращение загрязнения от неопластических ВПЧ-инфицированных клеток, прилегающих к опухоли. В целом, его хорошие показатели диагностики он считается золотым стандартом для активной идентификации ВПЧ-инфекции. Поскольку взаимодействие вирусного белка E6 и E7 с клеточными белками pRb и p53 является обязательным для преобразования клеток, ВПЧ РНК CISH является функционально актуальным и остро отражает активную онкогенную инфекцию ВПЧ. Этот метод является клинически актуальным, а так как “низкий” или “высокий” уровень транскрипции ВПЧ помогли определить две группы прогноза среди ВПЧ связанных p16-положительных больных раком головы и шеи. Здесь мы представляем протокол для ручного ВПЧ РНК CISH выполняется на формалин фиксированной парафина встроенных (FFPE) слайды с комплектом, полученным от производителя. Вместо хромогенного откровения, РНК на месте гибридизации также может быть выполнена с флуоресцентным откровением (РНК FISH). Он также может сочетаться с обычными иммуностоинга.
Introduction
ВПЧ РНК CISH является мощным инструментом для обнаружения активной инфекции ВПЧ, которые могут оказаться решающими в доброкачественных или злокачественных поражений в различных местах, таких как ротоглотки или шейки матки. Обнаружение активной инфекции ВПЧ может способствовать диагностике поражений, вызванных ВПЧ, и, таким образом, влиять на его лечение и прогноз.
ВПЧ является наиболее частой инфекцией, передаваемой половым путем, и более 100 вирусных генотипов были описаны1. Схематично, генотипы низкого риска, такие как генотипы 6 и 11, как известно, вызывают генитальные бородавки, рецидивирующие респираторные папилломатоз и другие доброкачественные поражения, в то время как генотипы высокого риска, такие как генотипы 16, а также 18, отвечают за большинство раковых заболеваний шейки матки и анальный рак и играют роль в ONSCC онкогенеза в переменных пропорциях, как учтивается региональными эпидемиологическими данными2.
Для выявления ВПЧ-инфекции имеется несколько инструментов. Как высокого риска ВПЧ инфекции приводит к выражению вирусных онкогенных белков E6 и E73, обнаружение E6 и E7 стенограммы широко рассматривается как золотой стандарт для активной идентификации ВПЧ инфекции4. ВПЧ РНК CISH может быть выполнена на образцах FFPE, которые довольно легко получить от пациентов, страдающих от различных заболеваний, связанных с ВПЧ. Его производительность была оценена в плоской интраэпителиальной неоплазии в шейке матки, ануса и влагалища, и в инвазивных плоскоклеточной карциномы в шейке матки, анус, и верхний аэропищеварительный тракт5: он достигает чувствительности более 98% среди ВПЧ ДНК-полимеразы цепной реакции (ПЦР) -положительных случаев. Это немного лучше, чем p16 иммуностоинга (93%) и ДНК ВПЧ на месте гибридизации (ДНК ISH: 97%), которые чаще используются. В другой когорте из 57 пациентов с плоскоклеточной карциномой (SCC), вытекающей из области головы и шеи, области половых органов, кожи и мочевыводящих путей, по сравнению с ВПЧ ДНК ISH, ВПЧ РНК CISH достигла лучшей чувствительности (100% против 88%) и специфика (87% против 74%)6.
P16 иммуностоинга является косвенным маркером, отражающим нарушение клеточного цикла, которые могут быть вызваны (но не исключительно) впч-инфекцией4,7. Этот экономически эффективный тест обладает хорошей чувствительностью и отрицательным прогностическим значением и рекомендуется в качестве суррогатного маркера инфекции ВПЧ высокого риска при раке ротоглотки (OPC) Колледжем американских патологоанатомов (CAP) и Союзом международных Борьба с раком (UICC)8.
Хотя эта статья посвящена исключительно выявлению ВПЧ в HNSCC, ВПЧ РНК CISH клинически актуальна в различных других условиях, которые связаны с ВПЧ-инфекцией. Например, этот метод может повысить точность диагностики низкосортных плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки (LSIL, ранее известный как цервикальная интраэпителиальная неоплазия, класс 1 «CIN1» для морфологически неоднозначных случаев9. Что касается ротоглотки SCC, ВПЧ РНК CISH позволяет идентификации ВПЧ связанных SCC, помечены как отличие от ВПЧ-не связанных ротоглотки SCC в недавнем восьмом издании TNM классификации головы и рака шеи (Союза для международного рака Управление (UICC)10. Так как ВПЧ связанных SCC экспонатов лучший прогноз с более длительной выживаемости и повышенной лучевой терапии и химиотерапии чувствительность, чем ВПЧ-не связанных SCC11,12,13, обнаружение впч-инфекции может повлиять управление пациентом14,15. Кроме того, ВПЧ РНК CISH может быть использован для диагностики ВПЧ связанных мультифенотипической синуазальной карциномы с более высоким сигналом, чем ВПЧ ДНК CISH16. Несколько многовариантных анализов показывают, что обнаружение стенограмм E6 и E7 коррелирует с лучшим прогнозом в ротоглофалии SCC в целом7,15,17,18 и в подгруппа p16-позитивной ротоглотки SCC19,20.
Здесь мы представляем протокол для ручного ВПЧ РНК CISH выполняется на слайдах FFPE с комплектом, полученным от производителя.
Protocol
Representative Results
Discussion
ВПЧ РНК CISH выполняется с приобретенным комплектом является мощным инструментом для обнаружения вирусных стенограмм и он указывает на активную инфекцию ВПЧ. Выполненные вручную, шаги протокола в целом легко следовать, и приобрел комплект удобно. Этот метод позволяет окрашивать 19 гисто…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят кафедру патологии Хопитал Европеен Джордж Помпиду и Некер (ЛаурианН Шамболле, Элоди Мишель и Гизеле Легалл); гистологическая платформа PARCC, Хопитал Европеен Джордж Помпиду (Коринн Лесаффр); Вирджиния Кларк для редактирования языка; Александра Эльбакян за ее вклад.
Materials
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
References
- Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
- Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?. Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
- Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
- Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
- Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
- Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
- Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
- Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
- El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. . WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
- Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
- Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
- Kuo, K. -. T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
- Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
- Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
- Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
- Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
- Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).
