כרומוגניים היברידיזציה באתרו הכלי עבור אבחון הקשורות HPV וסרטן צוואר
Summary
וירוס הפפילומה האנושי (HPV) כרומוגניים בתוך היברידיזציה באתרו נחשב לאחד מתקני זהב לגילוי זיהום וירוס הפפילומה האנושי בתוך גידולים. זה מאפשר ויזואליזציה של HPV E6-E7 ביטוי mRNA עם לוקליזציה והערכה כמותית למחצה של האות שלה.
Abstract
נגיף הפפילומה האנושי (HPV) זיהום הוא גורם סיכון מרכזי עבור תת-סוג של קרצינומה של תאים לוע קשקשיים (OPSCC), אשר נוטה להיות משויך לתוצאה טובה יותר מאשר אלכוהול וטבק OPSCC הקשורות. כרומוגניים היברידיזציה באתרו (CISH) של ה-RNA נגיפי HPV יכול לאפשר את הערכה כמותית למחצה של תעתיקים ויראלי של חלבונים אונגניים E6 ו E7 ו הדמיה באתרו עם רזולוציה מרחבית טובה. טכניקה זו מאפשרת את האבחנה של זיהום פעיל עם ויזואליזציה של שעתוק HPV ב-HPV מוסרי מזוהם תאים. היתרון של טכניקה זו הוא הימנעות זיהום מתאי HPV הנגועים שאינם נאופלסטיים הסמוכים לגידול. בסך הכל, הופעות אבחנה טובה שלה יש את זה נחשב כסטנדרט הזהב לזיהוי זיהום HPV פעיל. מאז E6 ו E7 אינטראקציה חלבון ויראלי עם חלבונים תא pRb ו p53 הוא חובה עבור שינוי התא, HPV RNA CISH הוא רלוונטי מבחינה פונקציונלית ומשקף זיהום HPV אונגניים פעיל. טכניקה זו היא רלוונטית קלינית, כמו גם מאז “נמוך” או “גבוהה” התעתיק HPV רמות עזר זיהוי של שתי קבוצות פרוגנוזה בקרב HPV הקשורות p16-הראש והצוואר סרטן החולים. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול עבור HPV הידני RNA CISH ביצע על formalin-קבוע פרפין-מוטבע (FFPE) שקופיות עם ערכת שהתקבל מהיצרן. במקום ההתגלות כרומוגניים, RNA באתרו היברידיזציה ניתן גם לבצע עם גילוי פלורסנט (ה-RNA FISH). ניתן גם לשלב אותו עם כתמים קונבנציונליים.
Introduction
HPV RNA CISH הוא כלי רב עוצמה לאיתור זיהום HPV פעיל, אשר עשוי להוכיח קריטי נגעים שפירים או ממאירים במיקומים שונים כגון oropharynx או צוואר הרחם הרחם. זיהוי של זיהום HPV פעיל עשוי לתמוך באבחון של נגע HPV המושרה, ובכך, להשפיע על הטיפול והפרוגנוזה שלה.
HPV הוא זיהום המועברות באופן מיני התכוף ביותר, ויותר מ-100 גנוטיפים ויראליות תוארו1. באופן שונה, גנוטיפים בסיכון נמוך כגון גנוטיפים 6 ו -11 ידועים לגרום יבלות באברי המין, ונשנים הפפילומה הנשימה, נגעים שפירים אחרים, בעוד גנוטיפים בסיכון גבוה כגון גנוטיפים 16 וגם 18 אחראים לסרטן צוואר הרחם ביותר וסרטן אנאלי לשחק תפקיד ב-HNSCC אונגנזה בפרופורציות משתנה כפי שנספרו על ידי נתונים אפידמיולוגיים האזורית2.
כלים מספר זמינים לזיהוי של זיהום HPV. כמו זיהום HPV סיכון גבוה מוביל לביטוי של חלבונים אונגניים ויראלי E6 ו E73, זיהוי של E6 ו E7 התעתיקים הוא הוצג באופן נרחב כמו תקן זהב עבור הזיהוי הפעיל HPV זיהום4. HPV RNA CISH יכול להתבצע על דגימות FFPE כי הם די בקלות מתקבלים מחולים הסובלים ממחלות HPV הקשורות שונות. הביצועים שלו כבר הוערך ב neoplasia קשקשיים האפיתל בצוואר הרחם, את פי הטבעת, ואת הנרתיק, ו קרצינומה של תאים פולשנית בצוואר הרחם, פי הטבעת, ואתבמערכת העיכול העליון aerodigestive: היא משיגה רגישות של מעל 98% בין התגובה לשרשרת HPV DNA פולימראז (PCR)-מקרים חיוביים. זה קצת יותר טוב מאשר p16 כתמים (93%) ו-DNA HPV באתרו היברידיזציה (DNA ISH: 97%), אשר נפוצים יותר בשימוש. בקבוצה אחרת של 57 חולים עם קרצינומה של תאים קשקשיים (SCC) הנובעים מן הראש והצוואר, אזור איברי המין, העור, ואת דרכי השתן, לעומת HPV DNA ISH, HPV RNA CISH השיגה רגישות טובה יותר (100% לעומת 88%) וספציפיות (87% לעומת 74%)
P16 חיסוני הוא סמן עקיף המשקף מחזור התא שיבושים שעלולים להיגרם (אך לא באופן בלעדי) על ידי זיהום HPV4,7. זה מבחן חסכוני בעל רגישות טובה וערך ניבוי שלילי מומלץ כסמן פונדקאית של זיהום בסיכון גבוה HPV בסרטן oropharynx (OPC) על ידי המכללה לפתוקולוגים אמריקאי (CAP) ועל ידי האיחוד עבור הבינלאומי בקרת סרטן (UICC)8.
למרות הנייר הזה רק מתמקד בזיהוי של HPV ב HNSCC, HPV RNA CISH הוא רלוונטי קלינית בתנאים אחרים שונים הכרוכים זיהום HPV. למשל, טכניקה זו עשויה לשפר את הדיוק של האבחנה של נגעים בדרגה נמוכה האפיתל הפנימי של צוואר הרחם (LSIL, לשעבר המכונה הneoplasia הצוואר הצווארי, כיתה 1 [CIN1]) עבור מקרים דו-משמעיים מורפולוגית9. בנוגע לוע SCC, HPV RNA CISH מאפשר זיהוי של ה-HPV הקשורים SCC, המסומן בנפרד HPV-לא קשור לוע SCC במהדורה השמינית האחרונות של סיווג TNM של הראש והצוואר סרטן (של האיחוד לסרטן הבינלאומי שליטה [UICC])10. מאז scc הקשורות HPV מוצגים פרוגנוזה טובה יותר עם הישרדות ארוכה יותר הקרנות משופרות רגישות כימותרפיה מאשרHPV-שאינם קשורים,12,13, זיהוי של זיהום hpv עשוי להשפיע . ניהול החולה14,15 חוץ מזה, HPV RNA CISH יכול לשמש עבור האבחנה של קרצינומה של הקשורות HPV מרובת-הקשר עם אות גבוה יותר מאשר HPV DNA CISH16. כמה מנתח סטטיסטי מציע כי גילוי של E6 ו E7 התעתיקים מתואם עם פרוגנוזה טובה יותר לוע scc הכולל7,15,17,18 וב קבוצת המשנה של p16 חיובי לוע scc19,20.
כאן אנו מציגים את הפרוטוקול עבור HPV הידני RNA CISH ביצע על שקופיות FFPE עם ערכת שהתקבלו מן היצרן.
Protocol
Representative Results
Discussion
HPV RNA CISH ביצע עם ערכת רכש הוא כלי רב עוצמה לאיתור תעתיקים ויראלי וזה מעיד על זיהום HPV פעיל. ביצוע ידני, השלבים של הפרוטוקול הם קלים לביצוע באופן כללי, והערכה שנרכשה היא נוחה. טכניקה זו מאפשרת כתמים של 19 דגימות היסטולוגית בתוספת שקופית אחת בקרה בבת אחת, ואת החישוב נמשך סביב 8 h. חשוב לא לתת לדגימו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למחלקה לפתולוגיה של הופטל יורוטן ז’ורז ‘ פומפידו ונקקר (לורייה שאמבולל, אלודי מישל, וגילג לפני); פלטפורמת היסטולוגיה של PARCC, הופטל יורוטן ז’ורז ‘ פומפידו (קורין Lesaffre); וירג קלארק לעריכת שפה; אלכסנדרה Elbakyan עבור התרומה שלה.
Materials
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
References
- Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
- Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?. Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
- Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
- Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
- Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
- Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
- Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
- Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
- El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. . WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
- Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
- Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
- Kuo, K. -. T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
- Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
- Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
- Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
- Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
- Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).
