Hibridização in situ cromogênica SS uma ferramenta para diagnóstico de câncer de cabeça e pescoço relacionados ao HPV
Summary
A hibridação in situ cromogênico do RNA do papilomavírus humano (HPV) é considerada ser um dos padrões do ouro para a deteção humana ativa da infecção do papilomavírus dentro dos tumores. Permite a visualização da expressão de mRNA de HPV E6-E7 com localização e avaliação semiquantitativa de seu sinal.
Abstract
A infecção pelo papilomavírus humano (HPV) é um fator de risco importante para um subtipo de carcinoma epidermóide orofaríngeo (OPSCC), que tende a estar associado a um melhor desfecho do que o OPSCC relacionado ao álcool e ao tabaco. A hibridação in situ chromogenic (cish) do RNA viral de HPV poderia permitir a avaliação semiquantitativa de transcritos virais das proteínas oncogênico E6 e E7 e de um visualização in situ com uma boa definição espacial. Essa técnica permite o diagnóstico de uma infecção ativa com a visualização da transcrição do HPV nas células tumorais infectadas pelo HPV. Uma vantagem desta técnica é a vacância da contaminação das pilhas HPV-infectadas nonneoplastic adjacentes ao tumor. Globalmente, seus desempenhos bons do diagnóstico têm-no considerado ser o padrão do ouro para a identificação ativa da infecção de HPV. Desde que a interação viral da proteína E6 e E7 com proteínas da pilha PRB e p53 é obrigatória para a transformação da pilha, o RNA cish de HPV é funcional relevante e reflete agudamente a infecção oncogênico ativa de HPV. Esta técnica é clinicamente relevante, bem como os níveis de transcrição do HPV “baixo” ou “alto” ajudaram na identificação de dois grupos de prognóstico entre os pacientes com câncer de cabeça e pescoço P16-positivos relacionados ao HPV. Aqui nós apresentamos o protocolo para o RNA manual CISH do HPV executado em corrediças parafina-encaixadas formalin-fixadas (FFPE) com um jogo obtido do fabricante. Em vez de revelação cromogênica, a hibridação in situ de RNA também pode ser realizada com revelação fluorescente (RNA FISH). Também pode ser combinada com imunocoloração convencional.
Introduction
O RNA cish de HPV é uma ferramenta poderosa para a deteção da infecção ativa de HPV, que pode provar crucial em lesões benignas ou malignos em vários locais tais como o orofaringe ou o colo uterino. A detecção de uma infecção ativa por HPV pode apoiar o diagnóstico de uma lesão induzida pelo HPV e, assim, influenciar seu tratamento e prognóstico.
O HPV é a infecção sexualmente transmissível mais frequente, e mais de 100 genótipos virais foram descritos1. De forma esquemática, genótipos de baixo risco, como os genótipos 6 e 11, são conhecidos por induzir verrugas genitais, papilomatose respiratória recorrente e outras lesões benignas, enquanto genótipos de alto risco, como genótipos 16 e também 18, são responsáveis pela maioria dos cânceres cervicais e cânceres Anais e desempenham um papel na oncogênese da HNSCC em proporções variáveis como contabilizadas por dados epidemiológicos regionais2.
Várias ferramentas estão disponíveis para a detecção de infecção por HPV. Como uma infecção por HPV de alto risco leva à expressão de proteínas oncogênicas virais E6 e E73, a detecção de transcritos E6 e E7 é amplamente vista como o padrão-ouro para a identificação ativa da infecção pelo HPV4. O RNA CISH de HPV pode ser executado em amostras de FFPE que são obtidas completamente facilmente dos pacientes que sofrem de várias doenças HPV-relacionadas. Seu desempenho tem sido avaliado em neoplasia intraepitelial escamosa no colo do útero, no ânus e na vagina, e no carcinoma epidermóide invasivo no colo do útero, no ânus e no trato aerodigestivo superior5: atinge uma sensibilidade de mais de 98% entre os casos positivos da reacção em cadeia do polymerase do ADN de HPV (PCR). Isto é ligeiramente melhor do que a imunomarcação P16 (93%) e a hibridação in situ do ADN de HPV (ADN ISH: 97%), que são mais de uso geral. Em outra coorte de 57 pacientes com carcinoma epidermóide (CEC) decorrente da região da cabeça e pescoço, da região genital, da pele e do trato urinário, comparado ao DNA do HPV, o ARN do HPV CISH obteve melhor sensibilidade (100% versus 88%) e especificidade (87% versus 74%)6.
A imunocoloração P16 é um marcador indireto refletindo o rompimento do ciclo celular que pode ser causado (mas não exclusivamente) pela infecção pelo HPV4,7. Este teste rentável possui boa sensibilidade e um valor preditivo negativo e é recomendado como um marcador substituto de infecção por HPV de alto risco no câncer de orofaringe (OPC) pelo Colégio de patologistas americanos (PAC) e pela União para o internacional Controle do câncer (UICC)8.
Embora este papel focalize unicamente na deteção do HPV em HNSCC, o RNA CISH de HPV é clinicamente relevante em várias outras circunstâncias que envolvem a infecção de HPV. Por exemplo, essa técnica pode melhorar a acurácia do diagnóstico de lesões intraepiteliais escamosas de baixo grau do colo do útero (LSIL, anteriormente conhecida como neoplasia intraepitelial cervical, grau 1 [NIC1]) para casos morfologicamente ambíguos9. Em relação ao CEC orofaríngeo, o ARN do HPV CISH permite a identificação do CEC relacionado ao HPV, rotulado como distinto do SCC orofaríngeo não relacionado ao HPV na recente oitava edição da classificação TNM do câncer de cabeça e pescoço (da União para câncer internacional Controle [UICC])10. Desde que o SCC HPV-relacionado apresenta um prognóstico melhor com sobrevivência mais longa e sensibilidade aumentada da radioterapia e da quimioterapia do que o SCC-não relacionado HPV11,12,13, a deteção da infecção de HPV pode impactar gerência paciente14,15. Adicionalmente, o RNA CISH de HPV pode ser usado para o diagnóstico da carcinoma sinonasal multiphenotypic HPV-relacionada com um sinal mais elevado do que o ADN CISH16de HPV. Várias análises multivariadas sugerem que a detecção de transcritos E6 e E7 está correlacionada com um melhor prognóstico em CEC orofaríngea global7,15,17,18 e no subgrupo de SCC orofaríngea P16-positivo19,20.
Aqui nós apresentamos o protocolo para o RNA manual CISH do HPV executado em corrediças de FFPE com um jogo obtido do fabricante.
Protocol
Representative Results
Discussion
O RNA CISH de HPV executado com um jogo comprado é uma ferramenta poderosa para a deteção de transcritos virais e indica a infecção ativa de HPV. Executado manualmente, as etapas do protocolo são gerais fáceis de seguir, e o kit comprado é conveniente. Esta técnica permite a coloração de 19 amostras histológicas mais uma corrediça do controle de uma vez, e o ensaio dura ao redor 8 h. É crítico não deixar as amostras secar entre as etapas a menos que mencionado de outra maneira. A condição do pré-tratam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao departamento de patologia de Hopital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel, e Gisèle legall); a plataforma de histologia do PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark para edição de idioma; Alexandra Elbakyan por sua contribuição.
Materials
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
References
- Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
- Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?. Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
- Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
- Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
- Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
- Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
- Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
- Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
- El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. . WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
- Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
- Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
- Kuo, K. -. T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
- Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
- Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
- Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
- Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
- Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).
