Chromogene in situ hybridisatie SS een hulpmiddel voor HPV-gerelateerde hoofd-en nek kankerdiagnose
Summary
Humaan papillomavirus (HPV) RNA chromogene in situ hybridisatie wordt beschouwd als een van de gouden normen voor actieve menselijke papillomavirus infectie detectie binnen tumoren. Het staat de visualisatie van HPV E6-E7 mRNA uitdrukking met localisatie en semiquantitative evaluatie van zijn signaal toe.
Abstract
Humaan papillomavirus (HPV) infectie is een belangrijke risicofactor voor een subtype van orofaryngeale plaveiselcel Cell carcinoom (OPSCC), die de neiging heeft te worden geassocieerd met een beter resultaat dan alcohol-en tabak-gerelateerde OPSCC. Chromogene in situ hybridisatie (CISH) van HPV virale RNA kan de semiquantitative evaluatie van virale transcripties van de oncogene eiwitten E6 en E7 en een in situ visualisatie met een goede ruimtelijke resolutie. Deze techniek maakt de diagnose van een actieve infectie met de visualisatie van de HPV-transcriptie in de tumorale HPV-geïnfecteerde cellen. Een voordeel van deze techniek is het vermijden van verontreiniging van nonneoplastic HPV-geïnfecteerde cellen grenzend aan de tumor. Globaal, heeft zijn goede diagnose prestaties het beschouwd als de gouden norm voor de actieve identificatie van de besmetting HPV te zijn. Sinds E6 en E7 virale eiwitinteractie met cel eiwitten pRb en p53 is verplicht voor cel transformatie, HPV RNA CISH is functioneel relevant en acuut weerspiegelt actieve oncogene HPV-infectie. Deze techniek is klinisch relevant en omdat “lage” of “hoge” HPV-transcriptie niveaus hielp de identificatie van twee prognose groepen onder HPV-gerelateerde P16-positieve hoofd-en nek kankerpatiënten. Hier presenteren we het protocol voorhand matige HPV-RNA CISH uitgevoerd op formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) dia’s met een kit verkregen van de fabrikant. In plaats van chromogene revelatie, kan de kruising van RNA in situ ook met fluorescente revelatie (de vissen van RNA) worden uitgevoerd. Het kan ook worden gecombineerd met conventionele immunokleuring.
Introduction
HPV RNA CISH is een krachtig hulpmiddel voor de opsporing van actieve besmetting HPV, die van essentieel belang in goedaardige of kwaadaardige letsels op diverse plaatsen zoals orofarynx of de baarmoeder cervix kan blijken. De opsporing van een actieve HPV-infectie kan ondersteunen de diagnose van een HPV-geïnduceerde laesie en, daardoor, invloed zijn behandeling en prognose.
HPV is de meest voorkomende seksueel overdraagbare infectie, en meer dan 100 virale genotypen zijn beschreven1. Schematisch, laag-risico genotypen zoals genotypen 6 en 11 zijn gekend om genitale wratten, terugkomende Ademhalings papillomatosis, en andere goedaardige letsels te veroorzaken, terwijl de hoog-risico genotypen zoals genotypen 16 en ook 18 voor de meeste cervicale kanker verantwoordelijk zijn en anale kankers en spelen een rol in HNSCC oncogenese in variabele verhoudingen, zoals verantwoord door regionale epidemiologische gegevens2.
Verschillende tools zijn beschikbaar voor de opsporing van HPV-infectie. Als een hoog-risico HPV-infectie leidt tot de expressie van virale oncogene eiwitten E6 en E73, de detectie van E6 en E7 transcripten wordt alom gezien als de gouden standaard voor actieve HPV-infectie identificatie4. HPV RNA CISH kan worden uitgevoerd op FFPE monsters die vrij gemakkelijk zijn verkregen van patiënten die lijden aan verschillende HPV-gerelateerde ziekten. De prestaties zijn geëvalueerd in plaveiselcel epitheliale neoplasie in de baarmoederhals, de anus, en de vagina, en in invasieve plaveiselcel cel carcinoom in de baarmoederhals, de anus, en de bovenste aerodigestive Tract5: het bereikt een gevoeligheid van meer dan 98% onder de polymerasekettingreactie van DNA van HPV (PCR)-positieve gevallen. Dit is iets beter dan P16 immunokleuring (93%) en HPV DNA in situ kruising (het ISH van DNA: 97%), wat meer algemeen worden gebruikt. In een andere cohort van 57 patiënten met plaveiselcel cel carcinoom (SCC) die voortvloeien uit het hoofd-en nek-gebied, de genitale regio, de huid, en de urinewegen, in vergelijking met HPV-DNA-ISH, HPV RNA CISH bereikt een betere gevoeligheid (100% versus 88%) en specificiteit (87% versus 74%)6.
P16 immunokleuring is een indirecte marker reflecterende cel cyclus verstoring die kunnen worden veroorzaakt (maar niet uitsluitend) door HPV-infectie4,7. Deze kosteneffectieve test bezit een goede gevoeligheid en een negatieve voorspellende waarde en wordt aanbevolen als een surrogaat marker van een hoog risico HPV-infectie in orofarynx Cancer (OPC) door het College van Amerikaanse patholoog (GLB) en door de Unie voor internationale De controle van kanker (UICC)8.
Hoewel dit document zich uitsluitend op de opsporing van HPV in HNSCC concentreert, is HPV RNA CISH klinisch relevant in diverse andere voorwaarden die besmetting HPV impliceren. Bijvoorbeeld, kan deze techniek de nauwkeurigheid van de diagnose van low-grade plaveiselcel epitheliale letsels van de cervix (LSIL, vroeger genoemd geworden cervicale epitheliale neoplasie, rang 1 [CIN1]) voor morfologisch dubbelzinnige gevallen9verbeteren. Wat orofaryngeale SCC, HPV RNA CISH maakt de identificatie van HPV-gerelateerde SCC, gelabeld als onderscheiden van HPV-niet-verbonden orofaryngeale SCC in de recente achtste editie van de TNM classificatie van hoofd-en nek kanker (van de Unie voor internationale kanker Controle [UICC])10. Sinds HPV-gerelateerde SCC vertoont een betere prognose met een langere overleving en verbeterde radiotherapie en chemotherapie gevoeligheid dan HPV-niet-verbonden SCC11,12,13, de opsporing van HPV-infectie kan gevolgen hebben geduldig beheer14,15. Bovendien, HPV RNA CISH kan voor de diagnose van HPV-verwant multifenotypic sinonasal carcinoom met een hoger signaal worden gebruikt dan HPV DNA CISH16. Verschillende multivariate analyses suggereren dat de detectie van E6 en E7 transcripten gecorreleerd is met een betere prognose in orofaryngeale SCC overall7,15,17,18 en in de subgroep van P16-positieve orofaryngeale SCC19,20.
Hier presenteren we het protocol voorhand matige HPV RNA CISH uitgevoerd op FFPE dia’s met een kit verkregen van de fabrikant.
Protocol
Representative Results
Discussion
HPV RNA CISH uitgevoerd met een gekochte Kit is een krachtig hulpmiddel voor de opsporing van virale transcripten en het geeft actieve HPV-infectie. Handmatig uitgevoerd, de stappen van het protocol zijn over het algemeen gemakkelijk te volgen, en de gekochte Kit is handig. Deze techniek kan de kleuring van 19 histologische monsters plus een controle dia in een keer, en de assay duurt ongeveer 8 uur. Het is van cruciaal belang niet te laten de monsters uitdrogen tussen de stappen, tenzij anders vermeld. De voor behandeli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken het departement pathologie van Hopital Européen Georges Pompidou en de Chantal Chambolle, Elodie Michel en Gisèle Legalel; het platform van de histologie van PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark voor het bewerken van talen; Alexandra Elbakyan voor haar bijdrage.
Materials
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
References
- Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
- Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?. Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
- Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
- Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
- Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
- Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
- Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
- Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
- El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. . WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
- Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
- Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
- Kuo, K. -. T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
- Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
- Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
- Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
- Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
- Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).
