Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Hitomi Fujisaki; Sugiko Futaki; Kazunori Mizuno; Shunji Hattori

doi:10.3791/59339

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioengineering

הערכת תקין התפשטות על שניים - שלושה ממדי מסוג קולגן מצעים

Published: April 22, 2019

doi:

10.3791/59339

Hitomi Fujisaki¹, Sugiko Futaki², Kazunori Mizuno¹, Shunji Hattori¹

¹Nippi Research Institute of Biomatrix, ²Department of Anatomy and Cell Biology,Osaka Medical College

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור הכנת בשתי צורות שונות של תרבות סובסטרטים ניצול מסוג קולגן. בהתאם דרך הטיפול קולגן, קולגן מולקולות לשמור על צורה דו-ממדית, הלא-סיבית או להרכיב מחדש לצורה תלת ממדי, fibril. התפשטות תאים על סוג הקולגן מושפע באופן משמעותי היווצרות fibril.

Abstract

מסוג קולגן, שימושי כמו מצע תא תרבות, קיים בשתי צורות: הטופס דו מימדי, שאינם סיבי תלת ממדי, טופס fibril. שתי הצורות ניתן להכין עם אותו סוג הקולגן. באופן כללי, הטופס סיבית מקדם הידבקות תאים והתפשטות. הטופס fibril (ג’ל) מספק יותר מצבים פיזיולוגיים סוגים רבים של תאים; לכן, תרבות ג’ל הוא שימושי עבור בחינת התנהגויות פיזיולוגיים של תאים, כגון יעילות התרופה.

החוקרים יכולים לבחור את הטופס המתאים בהתאם לצורך השימוש שלה. לדוגמה, במקרה של keratinocytes, שימש בג’ל תרבות כמו פצע ריפוי מודל. FEPE1L-8, קו תא תקין תרבותי בטופס סיבית מסוג אני קולגן, לקדם את התא אדהזיה. ראוי לציין, התפשטות תקין הוא איטי בטופס fibril מאשר הטופס סיבית. פרוטוקולים עבור הכנת מסוג קולגן כי תרבית תאים פשוטים, יש יישומים רחב בהתאם לצרכים ניסיוני.

Introduction

רקמות החיבור בין המרכיבים תלת ממדי חלבון meshwork של הרכב הטרוגנית, מורכב בעיקר סוג אני קולגן הסיבים¹. קולגן הסיבים לשחק תפקיד מפתח בדומה לפיגום עבור תאים¹^,²^,³ , אינטראקציה עם חלבונים אחרים מטריצה חוץ-תאית (ECM)³. במבחנה, שונה צורות מסוג קולגן יכול לשמש בשם דיאלקטריים תרבית תאים בהתאם הטיפול בשיטה¹^,²^,³^,⁴. בתנאים חומציים, מסוג קולגן שומרת על טופס סיבית⁵. ציפוי המשטח של תרבות מנות עם הטופס שאינם סיבי מקדמת תא אדהזיה והתפשטות⁶^,⁷. -פיזיולוגיים pH, טמפרטורה, סוג הקולגן מולקולות להרכיב מחדש לתוך הסיבים בצורת ג’ל אחזקת המבנה התלת-ממדי¹^,²^,³^,⁴^, ⁵^,–⁶^,–⁷^,–⁸. ישנם כמה חשוב הבדלים בין fibril לבין צורות סיבית מסוג אני קולגן, כולל מטריקס נוקשות ועל היעילות של שחזור של רכיבי ה-ECM על ידי התאים במהלך תרבות¹. מטריצת קשיחות הוא אחד הגורמים רגולטוריות הכי נחקרות תא תרבות¹^, ⁹. עם זאת, הגומלין המורכבים בין סובסטרטים התאים נשארים הבהרה. כדי לבחון את מורכבות האינטראקציות בין תאים לבין גורמים סביבתיים, מערכת פשוטה היא שימושית. השוואה של ההתנהגות הסלולר על שתי צורות שונות של קולגן עשוי לעזור כדי לפשט את השפעת גורמים סביבתיים. בהתאם, מטרת השימוש בהם, צורות שונות מסוג קולגן באופן סלקטיבי ניתן. בדרך כלל, keratinocytes נמצאים בקשר עם קרום המרתף אבל לא עם מסוג קולגן. עם זאת, במהלך ריפוי הפצע, keratinocytes לעבור רקמת חיבור עורי, להתרבות, לרפא את הפצע.¹⁰.

לאחרונה, אנחנו הראו כי ריכוז סידן חוץ-תאית חשוב עבור הפצת תקין שורת תאים באמצעות מערכת התרבות של הטופס fibril מסוג קולגן מחקה את רקמת חיבור עורי¹¹. כאשר הקו תא תקין FEPE1L-8 היה תרבותי של הטופס fibril מסוג קולגן, צורת התאים היה עגול, proliferations שלהם היו עצר של ריכוז סידן חוץ-תאית μM 30¹¹. כאשר ריכוז הסידן הוגדל ל 1.8 מ”מ, גדילת התאים היה התאושש¹¹. התאים גדל תחת שני ריכוזי סידן (30 μM ו 1.8 מ”מ) כאשר תרבותי טופס שאינם סיבי¹¹, ואילו הם היו רגישים יותר ריכוז הסידן אקסוגני כאשר תרבותי בטופס fibril. FEPE1L-8 נוצר באמצעות תרביות תאים עם וירוס הפפילומה סוג 16 הפיכת הגנים E6, E7 מן האנושי קרצינומה בצוואר הרחם, שאינם tumorigenic, לעכב את התפשטות ללא הגבלה עם פוטנציאל כמו נורמלי keratinocytes^{מוגבלת בידול 12}^,¹³. FEPE1L-8 תאים יכול להישמר באמצעות סוגים מסוימים של מדיום מסוים תקין, כולל סוג K110-II עם תוספת מוספים K-1 (K110)⁶. כאן, אנו מתארים פרוטוקול תרבות של הקו תא אנושי תקין-שאינו-סיבית, צורות fibril מסוג קולגן.

Protocol

1. הכנת תקין תרבות בינוני הערה: ביצוע כל ההליכים בתנאים אספטי. הוסף 5 מ של פניצילין-סטרפטומיצין ואת של תוספת מוספים K-1 עד 500 מ”ל של סוג K110-II בינונית (K110) באמצעות פיפטה של 10 מ”ל. 2. הכנת fibril בצורת מסוג קולגן הערה: לבצע הליכים עד שלב 2.6 בתנאים אספטי. לשמור 10 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS (-)), יונים, קולגן, צלחת 96-ובכן תרבות ומים של צינור 2-mL ריק על קרח.הערה: אין להשתמש באותה הצלחת כדי להכין את fibril ואת טפסים שאינם סיבי. להוסיף 1.12 מיליליטר מים יונים שפופרת ריק mL 2 באמצעות פיפטה. להוסיף 200 µL של x 10 PBS (-) המים בצינור 2 מ”ל באמצעות פיפטה של יונים. בעדינות לנער את הצינור מספר פעמים. מוסיפים 0.66 מ”ל של קולגן הצינור 2 מ”ל באמצעות פיפטה. בעדינות ובמהירות ללחוץ את הצינור מספר פעמים.הערה: יש להימנע בועות-צורה הפתרון ככל האפשר. להכין פתרון קולגן מיד לפני השימוש. יוצקים µL 100 של הפתרון קולגן מהשלב 2.3 לבאר כל צלחת 96-ובכן תרבות. בעדינות לרעוד לצלחת תרבות שמאלית תנועה ימינה.הערה: לכסות את המשטח כולו מן הבארות עם הפתרון קולגן. אם הפתרון אינו מכסה את כל פני השטח, להתפשט הפתרון באמצעות טיפ פיפטה. למנוע היווצרות בועה בפתרון ככל האפשר. למקם את הצלחת תרבות חממה2 CO, דגירה ב 37 ° C עבור 1 ח’ הסימון gelation של קולגן ולהעביר לצלחת תרבות אל ספסל נקי.הערה: אשר gelation על-ידי הטיית לצלחת תרבות. שופכים בעדינות µL 150 של K110 על ג’לים באמצעות פיפטה לאורך הקיר של הבאר, מקום התרבות צלחת בתוך חממה2 CO דגירה ב 37 ° C עבור ה 1 ההעברה לצלחת תרבות ספסל נקי. לפני תרבית תאים, בעדינות למחוק את K110 באמצעות פיפטה של.הערה: כדי להגן על ג’לים, קצה פיפטה צריך לגעת בקיר הבאר. 3. הכנת בצורת סיבית מסוג קולגן הערה: ביצוע כל ההליכים בתנאים אספטי. להוסיף 4 µL של קולגן 1.2 מ של 1 מ מ חומצת מימן כלורי (HCl) צינור 1.5 מ”ל ומערבבים בעדינות בעזרת פיפטה.הערה: להכין קולגן מיד לפני השימוש. לשמור קולגן HCl מקורר עד למועד השימוש. שופכים µL 100 של קולגן לתוך כל טוב של צלחת 96-ובכן תרבות באמצעות פיפטה. בעדינות לרעוד לצלחת תרבות שמאלית נכון תנועה, דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.הערה: ודא כי השטח כולו מן הבארות מכוסה פתרון. לאחר הדגירה, לבטל את הפתרון קולגן, לשטוף את הבארות עם PBS (-) פעמיים באמצעות פיפטה. יוצקים µL 150 של 1% שור אלבומין/PBS (-) (1% BSA) לבאר, צלחת תרבות 96-ובכן, דגירה בטמפרטורת החדר במשך ה 1 לפני תרבית תאים, למחוק את 1% BSA.הערה: ודא כי השטח כולו מן הבארות מכוסה פתרון. 4. התרבות של תאים FEPE1L-8 הערה: ביצוע כל ההליכים בתנאים אספטי. לשמור על תאים FEPE1L-8, K110 100 מ מ תרבות מנה בחממה2 CO ועל מודגרות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, כדי confluency למחצה. להכין K110 טריפסין, מעכבי טריפסין באמבט מים בטמפרטורה 37 º c בזהירות להסיר את המדיום של המנה תרבות, להוסיף 3 מ”ל של טריפסין 0.05% באמצעות פיפטה של, למקם את המנה חממה2 CO, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. לאחר דגירה, לבדוק ניתוק התא מפני השטח של המנה תרבות באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בהגדלה x 10.הערה: המורפולוגיה של תאי מנותקת הופך עגול. אם תפיץ התאים, דגירה, לתקופה נוספת של 5 דקות. להוסיף 3 מ”ל של מעכבי טריפסין ולאסוף בתאים שפופרת צנטרפוגה 15 מ”ל באמצעות פיפטה מנותקת. Centrifuge התאים שפופרת צנטרפוגה 15 מ”ל ב g x 200 במשך 5 דקות. למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה של K110 באמצעות פיפטה של 10 מ”ל. לספור את התאים באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בהגדלה x 10 והכן תא ריכוז-5.0 x 104 תאים למ”ל על ידי דילול המתאים עם K110. בעדינות זרע 0.1 מ”ל של K110 עם תאים בבאר בכל צלחת תרבות באמצעות פיפטה לאורך הקיר של הבאר. הכנס את הצלחת תרבות חממה2 CO, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך הזמן המצוין (h 2, 1 יום, 3 ימים).הערה: כדי להגן על ג’לים, קצה פיפטה צריך לגעת בקיר הבאר. 5. אומדן של מספר התאים קיימא דגירה K110 באמבט מים בטמפרטורה 37 º c מיקס 130 µL של tetrazolium מלח, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, מונוסודיום מלח (wst, מרץ-8) ו- 1.3 מ של K110 צינור 2-mL באמצעות פיפטה. להעביר לצלחת תרבות ספסל נקי ולמחוק בעדינות את K110 באמצעות פיפטה של. בעדינות לשטוף תאים שאינם מחסידי K110 באמצעות פיפטה הוסף µL 110 של K110 מעורבב עם wst, מרץ-8 בכל טוב באמצעות פיפטה של, למקם את הצלחת תרבות חממה2 CO, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. להעביר לצלחת תרבות ספסל נקי, לאסוף 100 µL של המדיום ממוזגים מכל קידוח, והעברתו לבאר צלחת 96-ובכן תרבות אחרת. למדוד את ספיגת באורך-גל של 450 nm (OD450) באמצעות microplate לקורא להעריך מספר התאים קיימא.

Representative Results

ייצוג סכמטי של הטיפול של המשטחים של מנות תרבות באמצעות שימוש מסוג קולגן מתואר באיור1. תא מורפולוגיות נצפתה בטפסים שאינם-סיביים וקשים fibril מוצגים הפאנלים מצד שמאל ימין של איור 2, בהתאמה. FEPE1L-8 תאים היו תרבותי עבור 2 h (לוחות העליון) ו- 3 ימים (לוחות נמוכה יותר). ב- h 2 הראשונית של culturing, התאים דבקה ולהתפשט על שתי צורות של קולגן (איור 2, לוחות העליון). שלושה ימים לאחר זריעה, תאים בטופס שאינם סיבי המשיך להתפשט וסלולרי מספרם גדל (איור 2, החלונית השמאלית התחתונה). לעומת זאת, התאים בטופס fibril הראו מוגבלת מפיצים (איור 2, החלונית התחתונה נכון). FEPE1L-8 התאים המשיך להתרבות בטופס סיבית מסוג אני קולגן (איור 3, קו שחור מלא, סגור עיגולים שחורים), על המנה לא מטופלת משטחים (איור 3, מנוקד קו אפור, עיגולים אפורים סגור). לעומת זאת, תאי לא להתרבות בטופס fibril (איור 3, קו מנוקד, עיגולים פתוח). איור 2 ו- 3 איור שונו מ Fujisaki ואח ’11. איור 1 : ייצוגים סכמטי של תרבות מאכל משטחים שטופלו סוג אני קולגן. בתנאים חומציים, מסוג קולגן הספוחה הם מולקולות על פני השטח של תבשיל בצורה הלא-סיבית (החלונית הימנית). בתנאים ניטרליים ב 37 מעלות צלזיוס, מסוג קולגן מולקולות הן לתוך הסיבים ואת הספוחה על פני השטח של מנות בצורת ג’ל (לוח נכון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : המורפולוגיה של תאי FEPE1L-8- תאים FEPE1L-8 K110 היו תרבותי באמצעות הטופס סיבית (10 µg/mL; לוחות שמאלה) או צורה fibril (1 מ”ג/מ”ל; לוחות הנכון) של סוג הקולגן כבר שעתיים (לוחות העליונה) או 3 ימים (לוחות נמוכה יותר). לבן מציינות 100 מיקרומטר. איור 2 שונה מ- Fujisaki et al. איור 1E – H11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : התפשטות תא FEPE1L. מספר התאים קיימא הוערך על גבי טופס שאינו סיביים (קו שחור מלא, מלא עיגולים שחור) או על fibril הטופס (קו מנוקד, עיגול פתוח) של מסוג קולגן, או תבשיל שאינו מטופל משטחים (קו מנוקד אפור, אפור מלא עיגולים) עבור 2 h, יום 1, ו- 3 ימים. הניסויים בוצעו ב triplicates ואת הערכים מוצגים אמצעי + SD. איור זה השתנה מ Fujisaki et al. איור 1J11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

כמה רכיבים ECM, כולל מסוג קולגן, טופס תלת ממדי מבני ויוו¹. Culturing על כזה תלת ממדי, ג’ל המצע מספק יותר מצבים פיזיולוגיים vitr בo מאשר על משטח דו מימדי פלסטיק¹^,²^,³^,⁴. פרוטוקולים רבים בנוגע לשיטת תרבות ג’ל דווחו, כגון שימוש מסוג קולגן¹^,²^,³^,⁴^,⁶^,⁷^, ¹¹, הסוג הרביעי קולגן¹⁴^,¹⁵Matrigel¹⁶. סוג הקולגן הוא חומר מוגדרים היטב והשימוש בהם נפוץ בשל שפע קלות הטיפול. התכונות של סוג מטוהרים אני קולגן תלוי בבעלי חיים מינים, גיל, טיהור שיטות⁵^,¹⁷. סוג הקולגן יטוהר באמצעות חומצה אצטית ו/או פרוטאזות, כגון פפסין, פפאין ו proctase⁵^,¹⁷. חומצה-מסיסים קולגן שומרת על telopeptides אמינו קולגן פרוטאז מסיסים הם cleaved אמינו-telopeptides⁵^,¹⁷. אורך שמורות אמינו-telopeptides תלוי בסוג של פרוטאזות, ואת הנוכחות של telopeptides משפיע על מורפולוגיה fibril ג’ל חוזק⁵^,¹⁷. צמיגות של הסיבים מסיסים חומצה קולגן הוא גדול יותר מזה של collagens שטופלו פרוטאז¹⁷. במחקר זה, השתמשנו חומצה-מסיסים שור מסוג קולגן. קולגן פפסין-solubilized יכול לשמש גם בפרוטוקול תרבות זו ג’ל ‘; אולם, הכוח ג’ל הוא חלש יותר¹⁷. הבדלים אלה חומרים יכולים לגרום הבדלים התנהגותיים התא, אך הם כיום אינם מובנים היטב.

פרוטוקול תרבות ג’ל המתוארים במחקר זה היא פשוטה מאוד. בשינויים רבים בשיטה זו דווחו. שינוי אפשרי אחד לתרבות של keratinocytes היא לחקות את קרום המרתף. ג’לים קולגן סוג IV ייתכן שעדיף לשמור על מבנה דמוי קרום המרתף המצע חוץ גופית¹⁵^,¹⁸. עם זאת, תקופת הדגירה ארוכה נדרש על פי סוג IV קולגן ג’לים¹⁴^,¹⁵^,¹⁸. במקום זאת, ערבוב קולגן סוג IV עם מסוג קולגן ג’לים יכול לייצר תרבות הרומן מצעים (מסוג I / סוג IV קולגן היברידית ג’לים)¹⁹. ג’לים היברידית אלה הן קל לטפל, דרוש זמן קצר עבור gelation, תשואה יותר תנאים כמו קרום המרתף keratinocytes. על סוג / סוג IV קולגן היברידית ג’ל, keratinocytes לשרוד, יוצרים מושבות, זירוז התמיינות סופנית¹⁹. שיטה זו היברידית כולל מיכלים.

באמצעות התרבות בג’ל מסוג קולגן משפיע על תאים סרטניים. של הטופס fibril מסוג קולגן, Akt ההפעלה ואת הצמיחה של קאקו-2 תאים (קו תא קולון סרטן) הם מודחקים⁷. בנוסף, הצמיחה של תאים מלנומה אנושיים (M24met) על גבי טופס fibril נעצר בקו ה G1/S במחסום²⁰. יתר על כן, רמות גבוהות במידה ניכרת של מינים חמצן תגובתי הם נצפו preadipocytes מאתר 3T3-L1 תרבותי בטופס fibril. יתר על כן, התפשטות תאים והעברה הם גירוי בכיוונים מנוגדים על ידי אי-סיבית, צורות fibril מסוג קולגן²¹.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים על ד ר ק’! סגיקוצ’י (מכון למחקר חלבון, באוניברסיטת אוסקה), ד ר מ’ יאמאדה (מכון למחקר חלבון, באוניברסיטת אוסקה), ד ר טי Ikejima (סין-יפן מחקר מכון הרפואה, מדעי הרוקחות, מכללת Wuya חדשנות, שניאנג התרופות האוניברסיטה) ו ט הייאשי (סין-יפן מחקר מכון הרפואה, מדעי הרוקחות, מכללת Wuya של חדשנות, שניאנג התרופות האוניברסיטה) עבור הערות מועילות.

Materials

Albumin, from bovine serum (BSA)	Merck KGaA	A4503
1 % BSA	Merck KGaA	A4503	Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	347-07621	tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8)
Collagen type I (Acid soluble collgen)	Nippi Inc.	ASC-1-100-20	from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL
disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate	ADVANTEC Co., LTD.	25CS020AS	0.2 µm pore size
human keratinocyte line cell FEPE1L-8			Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)
K-1	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin
K110 Type-II medium	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	keratinocyte basal culture medium
K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110)	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium
PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate
10x PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate
Penicillin-Streptomycin	MP Biomedicals, LLC	1670049	10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline
Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4	Merck KGaA	P-5368-10 pack
Trypsin from porcine pancreas	Merck KGaA	T4799
0.05 % trypsin	Merck KGaA	T4799	Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate
Trypsin inhibitor from soybean	FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation	202-20123
Trypsin inhibitor	FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation	202-20123	Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate

References

Kanta, J. Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior. Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).
Kleinman, H. K. Fibroblast adhesion to collagen substrates. Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).
Kleinman, H. K., Haralsonand, M. A., Hassell, J. R., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. , 289-301 (1995).
Yamato, M., Hayashi, T., Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. Extracellular Matrix-Cell Interaction. , 123-140 (1998).
Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen. Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).
Fujisaki, H., Hattori, S. Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling. Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).
Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils. Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).
Wang, Z., Li, R., Zhong, R. Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).
Shih, Y. -. R., Tseng, K. F., Lai, H. -. Y., Lin, C. -. H., Lee, O. K. Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).
Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan. BioMed Resesrch International. , 179784 (2013).
Fujisaki, H., et al. Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8. Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).
Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames. Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).
Kaur, P., Carter, W. G. Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts. Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).
Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen. Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).
Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels. Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).
Yonemura, S. Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment. Plos One. 9, 112922 (2014).
Sato, K., et al. Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).
Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH. Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).
Hattori, S., et al. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. , (2015).
Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).
Liu, X., et al. Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration. Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Fujisaki, H., Futaki, S., Mizuno, K., Hattori, S. Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates. J. Vis. Exp. (146), e59339, doi:10.3791/59339 (2019).

Automatically Generated

הערכת תקין התפשטות על שניים - שלושה ממדי מסוג קולגן מצעים

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

Automatically Generated

הערכת תקין התפשטות על שניים - שלושה ממדי מסוג קולגן מצעים

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below