تقييم انتشار Keratinocyte على عمليات ثنائية وثلاثية الأبعاد في النوع الأول من ركائز الكولاجين
Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لإعداد نموذجين مختلفين من ركائز ثقافة الاستفادة من النوع الأول من الكولاجين. اعتماداً على كيفية معالجة الكولاجين، جزيئات الكولاجين أما الإبقاء على شكل ثنائي الأبعاد، وغير ليفية أو يحشدوا في شكل ثلاثي الأبعاد، فيبريل. النوع الأول من انتشار الخلايا في الكولاجين تتأثر جذريا بتشكيل فيبريل.
Abstract
النوع الأول من الكولاجين، مفيدة كركيزة للثقافة الخلية، توجد في شكلين: شكل ثنائي الأبعاد، وغير ليفية وثلاثية الأبعاد، فيبريل النموذج. يمكن إعداد النماذج معا بنفس النوع الأول من الكولاجين. وبصفة عامة، يشجع النموذج غير الليفي التصاق الخلايا وانتشارها. يوفر النموذج فيبريل (الهلام) أكثر الظروف الفسيولوجية في أنواع عديدة من الخلايا؛ ولذلك، ثقافة جل مفيد لدراسة السلوكيات الفسيولوجية للخلايا، مثل فعالية المخدرات.
الباحثون تحديد الشكل المناسب طبقاً للغرض من استخدامها. على سبيل المثال، في حالة الخلايا الكيراتينيه، استخدمت الثقافة في جل كجرح الشفاء النموذجي. FEPE1L-8، خط خلايا keratinocyte مثقف في النموذج غير الليفي من النوع أنا الكولاجين، وتعزيز التصاق الخلية. جدير بالذكر أن انتشار keratinocyte أبطأ في شكل فيبريل النموذج غير الليفي. بروتوكولات للتحضير للنوع الأول من الكولاجين لثقافة الخلية بسيطة ولها تطبيقات واسعة تبعاً للاحتياجات التجريبية.
Introduction
تشمل الأنسجة الضامة فراغي ثلاثي الأبعاد meshwork البروتين لتكوين غير المتجانسة، المقام الأول يتألف من نوع أنا ييفات الكولاجين1. تلعب دوراً رئيسيا سقالة للخلايا1،،من23 ييفات الكولاجين والتفاعل مع سائر البروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM)3. في المختبر، ومختلف أشكال النوع الأول يمكن استخدام الكولاجين كركائز لثقافة الخلية تبعاً للتعامل مع الأسلوب1،2،،من34. في ظل الظروف الحمضية، النوع الأول الكولاجين يحافظ النموذج غير الليفي5. طلاء سطح الأطباق الثقافة بالشكل غير الليفي يعزز خلية التصاق وانتشار6،7. في الأس الهيدروجيني الفسيولوجي، ودرجة الحرارة، النوع الأول من جزيئات الكولاجين يحشدوا في ييفات التي تشكل المواد الهلامية تمتلك هيكل ثلاثي الأبعاد1،2،،من34، 56،،،من78. وهناك عدة الهامة الاختلافات بين فيبريل وأشكال غير الليفي من النوع أنا الكولاجين، بما في ذلك تصلب مصفوفة والكفاءة لتعمير مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة بالخلايا أثناء الثقافة1. تصلب المصفوفة أحد العوامل التنظيمية درس أكثر من خلية الثقافة1، 9. ومع ذلك، تظل التفاعلات المعقدة بين ركائز والخلايا إلى توضيح. دراسة التفاعلات المعقدة بين الخلايا والعوامل البيئية، نظام بسيط مفيدة. مقارنة بين سلوك الخلوية في شكلين مختلفين من الكولاجين قد تساعد على تبسيط أثر العوامل البيئية. تبعاً لغرض استخدامها، وأشكال مختلفة من نوع أنا الكولاجين بشكل انتقائي استخدامها. عادة الكيراتينيه على اتصال الغشاء ولكن ليس مع النوع الأول من الكولاجين. ومع ذلك، أثناء التئام الجروح، نقل الخلايا الكيراتينيه للنسيج الضام الجلدي، تتكاثر، والتئام الجرح10.
في الآونة الأخيرة، أثبتنا أن تركيز الكالسيوم خارج الخلية مهم لانتشار keratinocyte خط الخلايا باستخدام نظام الثقافة في شكل فيبريل النوع الأول من الكولاجين محاكاة النسيج الضام الجلدي11. عند السطر الخلايا keratinocyte FEPE1L-8 كان مثقف في شكل فيبريل النوع الأول من الكولاجين، شكل الخلايا جولة وتوقفت عن بروليفيريشنز بتركيز كالسيوم خارج الخلية من 30 ميكرو11. عندما زاد تركيز الكالسيوم إلى 1.8 مم، كان نمو الخلايا المستردة11. الخلايا نمت تحت كلا تركيزات الكالسيوم (30 ميكرومتر و 1.8 مم) عند مثقف في النموذج غير الليفية11، في حين أنهم كانوا أكثر حساسية لتركيز الكالسيوم خارجية عند مثقف في النموذج فيبريل. FEPE1L-8 تم إنشاؤها عن طريق تعداء مع فيروس الورم الحليمي نوع 16 تحويل الجينات E6 و E7 من سرطان عنق الرحم البشري، غير الورمية، تمنع انتشار غير محدود مع التمايز محدود المحتملة مثل الكيراتينيه العادي 12،13. يمكن الحفاظ على الخلايا FEPE1L-8 باستخدام بعض أنواع keratinocyte المتوسطة المحددة، بما في ذلك نوع K110-الثاني مع الملحق المضافة K-1 (K110)6. هنا، يمكننا وصف البروتوكول الثقافة خط الخلايا keratinocyte البشرية في غير الليفي وأشكال فيبريل من النوع الأول من الكولاجين.
Protocol
Representative Results
Discussion
بعض مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة، بما في ذلك النوع الأول من الكولاجين، وهياكل المجراة في1من نموذج ثلاثي الأبعاد. استزراع في هذه الثلاثية الأبعاد، يوفر الركيزة جل الظروف الفسيولوجية أكثر في المنطقةس من على سطح ثنائي الأبعاد، والبلاستيك1،2،،من34. أبلغ عن بروتوكولات عديدة فيما يتعلق بالأسلوب الثقافة هلام، مثل استخدام النوع الأول من الكولاجين1،2،،من34،،من67، 11والنوع الرابع الكولاجين14،15ماتريجيل16. النوع الأول من الكولاجين مادة محددة تحديداً جيدا، وتستخدم على نطاق واسع بسبب وفرة وسهولة التعامل. ملامح نوع المنقي أنا الكولاجين تعتمد على الحيوان الأنواع، والعمر، وتنقية الأساليب5،17. النوع الأول من الكولاجين يمكن تنقيته باستخدام حمض الخليك و/أو البروتياز، مثل بيبسن وغراء بروكتاسي5،17. وتحتفظ الكولاجين القابل للذوبان في حمض الأمينية تيلوبيبتيديس والكولاجين القابل للذوبان في حوزتي هي ملصوق الأمينية تيلوبيبتيديس5،17. محجوز طول الأمينية تيلوبيبتيديس يعتمد على النوع البروتياز، ووجود تيلوبيبتيديس يؤثر على مورفولوجيا فيبريل وهلام5،القوة17. لزوجة ييفات الكولاجين القابل للذوبان في حمض أكبر من المعالجة بحوزتي collagens17. في هذه الدراسة، ونحن المستخدمة قابلة للذوبان في حمض الأبقار في النوع الأول من الكولاجين. يمكن أيضا استخدام الكولاجين بيبسن solubilized في هذا البروتوكول الثقافة جل؛ ومع ذلك، هو قوام جل أضعف17. يمكن أن يسبب هذه الاختلافات في المواد الاختلافات السلوكية الخلية، بل أنها حاليا ليست مفهومة جيدا.
البروتوكول الثقافة هلام، المذكورة في هذه الدراسة بسيط جداً. وأبلغ العديد من التعديلات لهذا الأسلوب. يتم تعديل ممكن واحد للثقافة الكيراتينيه لتقليد الغشاء الطابق السفلي. قد يكون من الأفضل للحفاظ على بنية الغشاء مثل الركيزة في المختبر15،18الجل الكولاجين النوع الرابع. ومع ذلك، مطلوب فترة حضانة طويلة تحضيرا للنوع الرابع الكولاجين الجل14،،من1518. بدلاً من ذلك، خلط الكولاجين النوع الرابع مع النوع الأول من المواد الهلامية الكولاجين يمكن أن تنتج ركائز الثقافة رواية (النوع الأول/النوع الرابع الكولاجين الهجين الهلام)19. هذه المواد الهلامية الهجين من السهل التعامل معها، وتحتاج إلى فترة زمنية قصيرة جيلاتيون، وتسفر عن مزيد من الشروط مثل غشاء الطابق السفلي للخلايا الكيراتينيه. في النوع الأول/النوع الرابع الكولاجين الهجين الهلام، الكيراتينيه البقاء على قيد الحياة، وتشكل مستعمرات، ويحفز التمايز المحطة الطرفية19. يحتوي هذا الأسلوب الهجين التطبيقات المتنوعة.
الثقافة في جل باستخدام النوع الأول من الكولاجين يؤثر على الخلايا السرطانية. في النموذج فيبريل من النوع الأول من الكولاجين، التنشيط Akt ونمو الخلايا كربونات الكالسيوم-2 (خط خلية سرطان القولون) وقمعت7. وباﻹضافة إلى ذلك، يلقي القبض على نمو الخلايا البشرية سرطان الجلد (M24met) على شكل فيبريل في نقطة تفتيش G1/S20. وعلاوة على ذلك، لوحظت مستويات زيادة ملحوظة للأنواع الأكسجين التفاعلية في برياديبوسيتيس موريني 3T3-L1 مثقف في النموذج فيبريل. وعلاوة على ذلك، يتم تحفيز تكاثر الخلايا والهجرة في اتجاهين معاكسين بغير الليفي وأشكال فيبريل من النوع الأول من الكولاجين21.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشعر بالامتنان للدكتور ك. سيكيجوتشي (معهد “بحوث البروتين”، جامعة أوساكا)، د. م. يامادا (معهد “بحوث البروتين”، جامعة أوساكا)، د. ت. إيكيجيما (الصين واليابان أبحاث المعهد من الطبية والعلوم الصيدلية، كلية ويا الابتكار، وجامعة شنيانغ الصيدلانية) و “هاياشي ت.” (الصين واليابان أبحاث معهد للطب والعلوم الصيدلية، كلية ويا للابتكار، جامعة شنيانغ الصيدلانية) التعليقات المفيدة.
Materials
| Albumin, from bovine serum (BSA) | Merck KGaA | A4503 | |
| 1 % BSA | Merck KGaA | A4503 | Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 347-07621 | tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8) |
| Collagen type I (Acid soluble collgen) | Nippi Inc. | ASC-1-100-20 | from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL |
| disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate | ADVANTEC Co., LTD. | 25CS020AS | 0.2 µm pore size |
| human keratinocyte line cell FEPE1L-8 | Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) | ||
| K-1 | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin |
| K110 Type-II medium | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | keratinocyte basal culture medium |
| K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110) | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium |
| PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate |
| 10x PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals, LLC | 1670049 | 10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline |
| Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4 | Merck KGaA | P-5368-10 pack | |
| Trypsin from porcine pancreas | Merck KGaA | T4799 | |
| 0.05 % trypsin | Merck KGaA | T4799 | Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
| Trypsin inhibitor from soybean | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | |
| Trypsin inhibitor | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
References
- Kanta, J. Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior. Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).
- Kleinman, H. K. Fibroblast adhesion to collagen substrates. Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).
- Kleinman, H. K., Haralsonand, M. A., Hassell, J. R., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. , 289-301 (1995).
- Yamato, M., Hayashi, T., Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. Extracellular Matrix-Cell Interaction. , 123-140 (1998).
- Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen. Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).
- Fujisaki, H., Hattori, S. Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling. Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).
- Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils. Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).
- Wang, Z., Li, R., Zhong, R. Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).
- Shih, Y. -. R., Tseng, K. F., Lai, H. -. Y., Lin, C. -. H., Lee, O. K. Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).
- Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan. BioMed Resesrch International. , 179784 (2013).
- Fujisaki, H., et al. Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8. Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).
- Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames. Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).
- Kaur, P., Carter, W. G. Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts. Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).
- Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen. Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).
- Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels. Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).
- Yonemura, S. Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment. Plos One. 9, 112922 (2014).
- Sato, K., et al. Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).
- Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH. Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).
- Hattori, S., et al. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. , (2015).
- Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).
- Liu, X., et al. Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration. Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).
