Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Hitomi Fujisaki; Sugiko Futaki; Kazunori Mizuno; Shunji Hattori

doi:10.3791/59339

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Bioengineering

Bewertung der Keratinozyten Verbreitung auf zwei- und dreidimensionale Typ I Kollagen Substrate

Published: April 22, 2019

doi:

10.3791/59339

Hitomi Fujisaki¹, Sugiko Futaki², Kazunori Mizuno¹, Shunji Hattori¹

¹Nippi Research Institute of Biomatrix, ²Department of Anatomy and Cell Biology,Osaka Medical College

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Zubereitung von zwei verschiedenen Formen der Kultursubstrate nutzen Typ I Kollagen. Je nach mit Kollagen Umgang Kollagenmoleküle entweder zweidimensionale, nicht faserigen Form beibehalten oder wieder zusammenbauen in Fibrille Dreidimensionalität. Zellproliferation auf Typ I Kollagen ist drastisch Fibrille Bildung betroffen.

Abstract

Typ I-Kollagen, nützlich als Substrat für die Zellkultur, existiert in zwei Formen: die zweidimensionale, nicht faserigen Form und Fibrille Dreidimensionalität. Beide Formen zubereitet werden, mit dem gleichen Typ I Kollagen. In der Regel fördert nicht faserigen Form Zelladhäsion und Verbreitung. Die Fibrille Form (Gele) bietet mehr physiologischen Bedingungen in vielen Arten von Zellen; Daher eignet sich Gel Kultur für physiologische Verhalten von Zellen, wie die Wirksamkeit von Medikamenten zu prüfen.

Forscher können das entsprechende Formular nach dem Zweck ihrer Verwendung auswählen. Im Falle von Keratinozyten, hat zum Beispiel auf Gel Kultur als ein Modell der Wundheilung eingesetzt. FEPE1L-8, eine Keratinozyten-Zelllinie kultiviert auf nicht-faserigen Form des Typs ich Kollagen, Zelladhäsion fördern. Insbesondere ist die Keratinozyten Verbreitung langsamer auf die Fibrille Form als nicht-faserigen Form. Protokolle für die Zubereitung von Typ I Kollagen für Zellkultur sind einfach und haben breite Anwendungen abhängig von den experimentellen Anforderungen.

Introduction

Interstitielle Bindegewebe bilden ein dreidimensionales Protein Geflecht aus heterogenen Zusammensetzung, hauptsächlich bestehend aus Typ ich Kollagen-Fibrillen-¹. Kollagen-Fibrillen spielen eine wichtige Rolle als Gerüst für Zellen¹^,²^,³ und interagieren mit anderen extrazellulären Matrix (ECM) Proteine³. In-vitro-, verschiedene Formen von Typ I-Kollagen eignet sich als Substrate für die Zellkultur abhängig von den Umgang mit Methode¹^,²^,³^,⁴. Unter sauren Bedingungen, Typ I Kollagen unterhält nicht faserigen Form⁵. Beschichten der Oberfläche der Kultur Gerichte mit nicht-faserigen Form fördert Zelle Adhäsion und Verbreitung⁶^,⁷. Bei physiologischen pH-Wert und Temperatur, Typ I Kollagenmoleküle wieder zusammenbauen in Fibrillen, die bilden Gele besitzen eine dreidimensionale Struktur¹^,²^,³^,⁴^, ⁵^,⁶^,⁷^,⁸. Es gibt einige wichtige Unterschiede zwischen der Fibrille und nicht faserigen Formen vom Typ ich Kollagen, einschließlich Matrix Steifigkeit und Effizienz des Wiederaufbaus des ECM-Komponenten durch die Zellen in der Kultur-¹. Matrix-Steifigkeit ist eines der am besten untersuchten regulatorische Faktoren der Zelle Kultur¹^, ⁹. Allerdings müssen die komplexen Wechselwirkungen zwischen Substraten und Zellen noch geklärt werden. Um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und Umweltfaktoren zu untersuchen, ist ein einfaches System nützlich. Vergleich des zellulären Verhaltens auf die zwei verschiedenen Formen von Kollagen kann helfen, um die Wirkung von Umweltfaktoren zu vereinfachen. Je nach dem Zweck ihrer Verwendung, verschiedene Formen des Typs ich kann Kollagen selektiv verwendet werden. Normalerweise Keratinozyten stehen in Kontakt mit der Basalmembran, aber nicht mit Typ I Kollagen. Jedoch bei der Wundheilung, Keratinozyten verschieben das dermale Bindegewebe, vermehren sich und heilt die Wunde¹⁰.

Vor kurzem, wir gezeigt, dass die Konzentration des extrazellulären Calcium wichtig für die Proliferation von Keratinozyten ist Linie Zellen durch Verwendung von Kultur über die Fibrille Form des Typ-I-Kollagen imitiert die dermale Bindegewebe¹¹. Wenn die Keratinozyten-Zell-Linie, die FEPE1L-8 die Fibrille Form kultiviert wurde Typ I Kollagen, die Form der Zellen war rund und ihre Proliferationen an eine extrazelluläre Calcium-Konzentration von 30 μM¹¹gestoppt wurden. Wenn die Calcium-Konzentration bis 1,8 mM erhöht wurde, war Zellwachstum wiederhergestellten¹¹. Die Zellen wuchsen unter beiden Kalzium-Konzentrationen (30 μM und 1,8 mM) als auf die nicht-faserigen Form¹¹, kultiviert, während sie empfindlicher auf die exogene Calcium-Konzentration, wenn auf dem Formular Fibrille kultiviert wurden. FEPE1L-8 wurde generiert durch Transfektion mit dem Papillomavirus Typ 16 verwandelnde Genen E6 und E7 von menschlichen zervikalen Karzinom, tumorigenic, hemmen unbegrenzte Verbreitung mit begrenzten Differenzierungspotenzial wie normale Keratinozyten¹²^,¹³. FEPE1L-8 Zellen können gepflegt werden, mit einigen Arten von Keratinozyten spezifisches Medium, einschließlich K110 Typ-II mit Additiven Ergänzung k-1 (K110)⁶. Hier beschreiben wir das Kultur-Protokoll von der menschlichen Keratinozyten-Zell-Linie auf die nicht-faserigen und Fibrille Formen des Typ-I-Kollagen.

Protocol

1. Vorbereitung der Keratinozyten Kulturmedium Hinweis: Führen Sie alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen. Fügen Sie 5 mL von Penicillin-Streptomycin und 10 mL additive Ergänzung k-1 500 mL K110 Typ-II-Medium (K110) mit einer Pipette. 2. Vorbereitung der Fibrille Form des Typ-I-Kollagen Hinweis: Führen Sie Verfahren erst Schritt 2.6 unter aseptischen Bedingungen. Halten Sie 10 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS (-)), deionisiertes Wasser, Kollagen, eine Kultur der 96-Well-Platte und einem 2-mL-Leerrohr auf Eis.Hinweis: Verwenden Sie nicht die gleiche Platte die Fibrille und nicht faserigen Formen vorbereiten. Eine leere 2-mL-Tube mit einer Pipette fügen Sie 1,12 mL entionisiertem Wasser hinzu. Deionisiertes Wasser in der 2 mL-Tube mit einer Pipette fügen Sie 200 µL 10 X PBS (- hinzu). Schütteln Sie das Röhrchen mehrmals. Der 2-mL-Tube mit einer Pipette fügen Sie 0,66 mL Kollagen hinzu. Schütteln Sie schonend und schnell das Röhrchen mehrmals.Hinweis: Vermeiden Sie die Blasenbildung in der Lösung so weit wie möglich. Bereiten Sie Kollagen Lösung unmittelbar vor dem Gebrauch. Gießen Sie 100 µL der Kollagen-Lösung von Schritt 2.3 in jede Vertiefung der Kultur der 96-Well-Platte. Schütteln Sie die Kultur-Platte in einer von links nach rechts Bewegung.Hinweis: Bedecken Sie die gesamte Oberfläche der Brunnen mit der Kollagen-Lösung. Wenn die Lösung nicht die gesamte Fläche abdeckt, verbreiten Sie die Lösung mit einer Pipettenspitze. Vermeiden Sie Blasenbildung in der Lösung so weit wie möglich. Die Kultur Platte in eine CO2 Inkubator und Inkubation bei 37 ° C für 1 h Check die Gelierung des Kollagens und die Kultur-Platte in einer sauberen Werkbank verschieben.Hinweis: Bestätigen Sie Gelierung durch Kippen der Kultur-Platte. Gießen Sie sanft auf die Gele mit einer Pipette entlang der Wand Brunnen, Ort die Kultur in einem CO2 Inkubator Platte und Inkubation bei 37 ° C für 1 h Umzug der Kultur-Platte in einer sauberen Werkbank 150 µL K110. Vor der Zellkultur, sanft verwerfen die K110 mit einer Pipette.Hinweis: Um die Gele zu schützen, sollte die Spitze der Pipette die Wand des Brunnens berühren. 3. Vorbereitung des nicht-faserigen Form von Typ I-Kollagen Hinweis: Führen Sie alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen. 1,2 mL Salzsäure (HCl) in einer 1,5 mL Tube 1 mM 4 µL des Kollagens hinzufügen und mit einer Pipette vorsichtig mischen.Hinweis: Bereiten Sie Kollagen unmittelbar vor dem Gebrauch. Halten Sie Kollagen und HCl gekühlt bis zum Zeitpunkt der Nutzung. Gießen Sie 100 µL des Kollagens in jede Vertiefung einer 96-Well-Kultur-Platte mit einer Pipette. Schütteln der Kultur-Platte in einer von links nach rechts Bewegung und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h.Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche der Brunnen mit Lösung bedeckt ist. Verwerfen Sie nach der Inkubation die Kollagen-Lösung zu und waschen Sie die Brunnen mit PBS (-) zweimal mit einer Pipette. 150 µL 1 % bovine Serum Albumin/PBS (-) (1 % BSA) zu einem Brunnen der Kultur der 96-Well-Platte gießen und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h vor der Zellkultur, die 1 % BSA entsorgen.Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche der Brunnen mit Lösung bedeckt ist. (4) Kultur der FEPE1L-8 Zellen Hinweis: Führen Sie alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen. Pflegen Sie FEPE1L-8 Zellen in K110 in einem 100 mm Schale in eine CO2 Inkubator Kultur und bei 37 ° C und 5 % CO2, semi-confluency inkubiert. Bereiten Sie K110, Trypsin und Trypsin-Inhibitor in einem Wasserbad bei 37 ° C. Sorgfältig entfernen Sie das Medium aus der Kulturschale, fügen Sie 0,05 % Trypsin mit einer Pipette 3 mL hinzu, legen Sie die Schale in eine CO2 Inkubator und bei 37 ° C für 5 min inkubieren. Überprüfen Sie nach der Inkubation Zelle Loslösung von der Oberfläche von der Kulturschale mit Phasenkontrast-Mikroskopie bei 10-facher Vergrößerung.Hinweis: Die Morphologie der freistehenden Zellen wird rund. Wenn die Zellen verteilt, um einen weiteren Zeitraum von 5 min inkubieren. Fügen Sie 3 mL Trypsin-Inhibitor und sammeln Sie die freistehenden Zellen in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen mit einer Pipette. Zentrifugieren Sie die Zellen in einem Zentrifugenröhrchen 15 mL 200 X g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und erneut aussetzen Sie das Pellet in 10 mL K110 mit einer Pipette. Zählen der Zellen mittels Phasenkontrast-Mikroskopie bei 10facher Vergrößerung und Zellkonzentration auf 5.0 x 104 Zellen/mL durch entsprechende Verdünnung mit K110 vorbereiten. Samen Sie sanft 0,1 mL K110 mit Zellen in jede Vertiefung der Kultur-Platte mit einer Pipette entlang der Wand des Brunnens. Die Kultur Platte in eine CO2 Inkubator und die angegebene Zeit (2 h, 1 Tag, 3 Tage) bei 37 ° C inkubieren.Hinweis: Um die Gele zu schützen, sollte die Spitze der Pipette die Wand des Brunnens berühren. (5) Schätzung der Anzahl der lebensfähigen Zellen Inkubieren Sie K110 in einem Wasserbad bei 37 ° c Mix-130 µL Tetrazoliumsalz Salz, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H Tetrazoliumsalz, Mononatrium-Salz (WST-8) und 1,3 mL K110 in der 2-mL-Tube mit einer Pipette. Verschieben die Kultur-Platte in einer sauberen Werkbank und sanft verwerfen die K110 mit einer Pipette. Waschen Sie vorsichtig entfernt nicht anhaftende Zellen mit K110 mithilfe einer pipette Fügen Sie WST-8 110 µL K110 beigemischt, in jeder gut mit einer Pipette, die Kultur Platte in eine CO2 Inkubator und Inkubation bei 37 ° C für 2 h. Verschieben der Kultur-Platte in einer sauberen Werkbank, 100 µL des konditionierten Mediums aus jedem Brunnen sammeln und verschieben Sie es in einen Brunnen von einer anderen Kultur 96-Well-Platte. Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm (OD450) mit einer Mikrotestplatte Leser und Schätzung der Anzahl der lebensfähigen Zellen.

Representative Results

Eine schematische Darstellung der Behandlung der Oberflächen von Kultur Gerichte mit Typ I Kollagen ist in Abbildung 1dargestellt. Zelle Morphologien auf die nicht-faserigen und Fibrille Formen beobachtet werden jeweils in den linken und rechten Seite von Abbildung 2, vorgestellt. FEPE1L-8 Zellen wurden für 2 h (oberen Platten) und 3 Tage (untere Platten) kultiviert. In den ersten 2 h der Kultivierung der Zellen eingehalten und auf beide Formen von Kollagen (Abbildung 2, oberen Platten) verteilen. Drei Tage nach der Aussaat, Zellen auf nicht-faserigen Form weiterhin verbreiten und Handy-Nummern erhöht (Abbildung 2, unten links). Im Gegensatz dazu zeigten die Zellen auf die Fibrille Form begrenzten Verbreitung (Abbildung 2, unteren rechten Bereich). FEPE1L-8 Zellen weiterhin vermehren sich auf nicht-faserigen Form des Typs ich Kollagen (Abbildung 3, durchgezogene schwarze Linie geschlossen schwarze Kreise) und auf die unbehandelte Schale Oberflächen (Abbildung 3, gepunktete graue Linie, geschlossene graue Kreise). Im Gegensatz dazu Zellen nicht auf die Fibrille Form (Abbildung 3, gepunktete Linie, offenen Kreise) vermehren. Abbildung 2 und Abbildung 3 wurden von Fujisaki Et Al11geändert. Abbildung 1 : Schematische Darstellungen der Kultur Gericht Oberflächen behandelt mit Kollagen. Unter sauren Bedingungen Typ I Kollagen, die Moleküle adsorbiert werden auf der Oberfläche eines Gerichtes in nicht-faserigen Form (linken). Unter neutralen Bedingungen bei 37 ° C Typ I Kollagen Moleküle sind in Fibrillen zusammengesetzt und adsorbiert an der Oberfläche der Gerichte in Gelform (rechte Abbildung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : Morphologie der Zellen der FEPE1L 8. FEPE1L-8 Zellen in K110 wurden kultiviert, mit dem nicht-faserigen Formular (10 µg/mL; linke Paneele) oder Fibrille Form (1 mg/mL; richtigen Platten) von Typ I-Kollagen für 2 h (oberen Platten) oder 3 Tage (untere Platten). Weiße Balken 100 µm. Abbildung 2 wurde geändert von Fujisaki Et Al. in Abbildung 1-E-H-11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Proliferation der Zelle FEPE1L-8. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurden geschätzt, auf die nicht-faserigen Form (durchgezogene schwarze Linie, schwarz gefüllte Kreise) oder auf die Fibrille Form (gepunktete Linie, offener Kreis) von Typ I Kollagen oder unbehandelte Schale Oberflächen (graue gepunktete Linie, Grau gefüllte Kreise) für 2 Stunden, 1 Tag und 3 Tage. Experimente wurden durchgeführt, in Triplicates und Werte als Mittel + SD dargestellt Diese Zahl wurde von Fujisaki Et Al. in Abbildung 1J11geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Einige ECM-Komponenten, einschließlich Typ I Kollagen, Form dreidimensionaler Strukturen in-vivo-¹. Kultivierung auf eine dreidimensionale, Gel-Substrat bietet mehr physiologischen Bedingungen in Vitro als auf eine zweidimensionale, Kunststoff Oberfläche¹^,²^,³^,⁴. Zahlreiche Protokolle über die Gel-Kultur-Methode berichtet, wie die Verwendung von Typ I Kollagen¹^,²^,³^,⁴^,⁶^,⁷^, ¹¹, Typ IV Kollagen¹⁴^,¹⁵und Matrigel¹⁶. Typ I-Kollagen ist eine klar definierte und am weitesten verbreiteten Material wegen seiner Fülle und einfache Handhabung. Die Merkmale des gereinigten Typ ich Kollagen hängen von der tierischen Art, Alter und Reinigung Methoden⁵^,¹⁷. Typ I-Kollagen kann mit Essigsäure und/oder Proteasen, wie Pepsin, Papain und Proctase⁵^,¹⁷gereinigt werden. Säure-lösliches Kollagen behauptet, amino-Telopeptides und Protease-lösliches Kollagen sind gespalten amino-Telopeptides⁵^,¹⁷. Die reservierten Länge des amino-Telopeptides hängt von der Art der Proteasen, und das Vorhandensein von Telopeptides betrifft Fibrille Morphologie und gel Stärke⁵^,¹⁷. Die Viskosität der Säure-lösliches Kollagen-Fibrillen ist größer als die der Protease behandelt kollagene¹⁷. In dieser Studie verwendeten wir Säure löslich Rinder Typ I Kollagen. Pepsin solubilisiert Kollagen kann auch in diesem Gel-Kultur-Protokoll verwendet werden; Allerdings ist die Gelstärke schwächer¹⁷. Diese Unterschiede in den Materialien können Zelle Verhaltensunterschiede verursachen, aber sie sind derzeit nicht bekannt.

Das Gel-Kultur-Protokoll in dieser Studie beschriebenen ist sehr einfach. Viele Modifikationen dieser Methode sind berichtet worden. Eine mögliche Änderung für die Kultur der Keratinozyten soll der Basalmembran imitieren. Typ IV Kollagen Gele möglicherweise besser, eine Basalmembran-wie Substrat-Struktur in vitro-¹⁵^,¹⁸zu halten. Eine lange Inkubationszeit ist jedoch erforderlich für die Zubereitung von Typ IV Kollagen Gel¹⁴^,¹⁵^,¹⁸. Stattdessen mischen Typ IV Kollagen mit Typ I Kollagen Gele können neuartige Kultursubstrate produzieren (Typ I / Typ IV Kollagen Hybrid Gele)¹⁹. Diese Hybrid-Gele sind leicht zu handhaben, erfordern eine kurze Zeit für die Gelierung und Ertrag mehr Basalmembran-ähnlichen Bedingungen für Keratinozyten. Auf Typ I / Typ IV Kollagen Hybrid Gele, Keratinozyten überleben, bilden Kolonien und terminal Differenzierung¹⁹zu induzieren. Diese Hybrid-Methode verfügt über vielseitige Einsatzmöglichkeiten.

Kultur auf Gel mit Typ I Kollagen wirkt sich Krebszellen. Die Fibrille Form des Typ-I-Kollagen, Akt Aktivierung und Wachstum von Caco-2 Zellen (ein Doppelpunkt Krebs Zell-Linie) sind unterdrückte⁷. Darüber hinaus wird das Wachstum der menschlichen Melanomzellen (M24met) auf die Fibrille Form bei der G1/S-Checkpoint-²⁰verhaftet. Darüber hinaus werden deutlich erhöhte Spiegel von reaktiven Sauerstoffspezies in murinen 3 t 3-L1 Präadipozyten kultiviert die Fibrille Form beobachtet. Darüber hinaus Zell-Proliferation und Migration werden in entgegengesetzte Richtungen stimuliert, durch die nicht-faserigen und Fibrille Formen des Typ-I-Kollagen²¹.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir sind dankbar, dass Dr. K. Sekiguchi (Institut für Proteinforschung, Osaka University), Dr. M. Yamada (Institut für Proteinforschung, Osaka University), Dr. T. Ikejima (China und Japan Research Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences, Wuya College of Innovation, Shenyang pharmazeutische Universität) und T. Hayashi (China und Japan Research Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences, Wuya College of Innovation, Shenyang pharmazeutische Universität) für die hilfreichen Kommentare.

Materials

Albumin, from bovine serum (BSA)	Merck KGaA	A4503
1 % BSA	Merck KGaA	A4503	Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	347-07621	tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8)
Collagen type I (Acid soluble collgen)	Nippi Inc.	ASC-1-100-20	from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL
disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate	ADVANTEC Co., LTD.	25CS020AS	0.2 µm pore size
human keratinocyte line cell FEPE1L-8			Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)
K-1	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin
K110 Type-II medium	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	keratinocyte basal culture medium
K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110)	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium
PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate
10x PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate
Penicillin-Streptomycin	MP Biomedicals, LLC	1670049	10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline
Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4	Merck KGaA	P-5368-10 pack
Trypsin from porcine pancreas	Merck KGaA	T4799
0.05 % trypsin	Merck KGaA	T4799	Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate
Trypsin inhibitor from soybean	FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation	202-20123
Trypsin inhibitor	FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation	202-20123	Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate

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Fujisaki, H., Futaki, S., Mizuno, K., Hattori, S. Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates. J. Vis. Exp. (146), e59339, doi:10.3791/59339 (2019).

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