Studie über den Stoffwechsel von sechs systemischen Insektiziden in einer neu etablierten Zellsuspensionskultur abgeleitet aus Tee (Camellia Sinensis L.) Blätter
Summary
Diese Arbeit präsentiert ein Protokoll zur Etablierung einer Zellsuspensionskultur aus Tee (Camellia sinensis L.) Blätter, die verwendet werden können, um den Stoffwechsel von externen Verbindungen zu studieren, die von der ganzen Pflanze aufgenommen werden können, wie Insektizide.
Abstract
Es wurde eine Plattform zur Untersuchung des Insektizidstoffwechsels mit In-vitro-Geweben von Teepflanzen entwickelt. Blätter aus sterilen Teepflanzen wurden dazu induziert, lose Callus auf Murashige und Skoog (MS) Basalmedien mit den Pflanzenhormonen 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure (2,4-D, 1,0 mg L-1) und Kinetin (KT, 0,1 mg L-1) zu bilden. Callus gebildet nach 3 oder 4 Runden Subkulierung, jede Dauer von 28 Tagen. Loser Callus (ca. 3 g) wurde dann in Flüssigmedien b5 geimpft, die die gleichen Pflanzenhormone enthielten, und in einem Schüttelinkubator (120 Umdrehungen pro Minute) im Dunkeln bei 25 °C bei 1 °C kultiviert. Nach 3-4 Subkulturen wurde eine aus DemTeeblatt gewonnene Zellsuspension in einem Subkulturverhältnis zwischen 1:1 und 1:2 (Suspensionsmutterflüssigkeit: frisches Medium) festgestellt. Auf dieser Plattform wurden sechs Insektizide (5 g ml-1 pro Thiamethoxam, Imidacloprid, Acetamiprid, Imidaclothiz, Dimethoat und Omethoat) in die von Teeblättern abgeleitete Zellsuspensionskultur aufgenommen. Der Stoffwechsel der Insektizide wurde mittels Flüssigchromatographie und Gaschromatographie verfolgt. Um die Nützlichkeit der Suspensionskultur der Teezellen zu validieren, wurden die Metaboliten von Thiamethoxan und Dimethoat in behandelten Zellkulturen und intakten Pflanzen mittels Massenspektrometrie verglichen. In behandelten Teezellkulturen wurden sieben Metaboliten von Thiamethoxan und zwei Metaboliten von Dimethoat gefunden, während in behandelten intakten Pflanzen nur zwei Metaboliten von Thiamethoxam und einer von Dimethoat gefunden wurden. Die Verwendung einer Zellsuspension vereinfachte die metabolische Analyse im Vergleich zur Verwendung intakter Teepflanzen, insbesondere für eine schwierige Matrix wie Tee.
Introduction
Tee ist eines der am häufigsten konsumierten alkoholfreien Getränke der Welt1,2. Tee wird aus den Blättern und Knospen der holzigen mehrjährigen Camellia sinensis L. Teepflanzen werden in riesigen Plantagen angebaut und sind anfällig für zahlreiche Insektenschädlinge3,4. Organophosphor und neonicotinoide Insektizide werden oft als systemische Insektizide5 verwendet, um Teepflanzen vor Schädlingen wie Weißfliegen, Blatttrichtern und einigen lepidopteranartenArten zuschützen 6,7. Nach der Anwendung werden diese Insektizide absorbiert oder in die Pflanze übertragen. Innerhalb der Pflanze können diese systemischen Insektizide durch Hydrolyse, Oxidation oder Reduktionsreaktionen durch Pflanzenenzyme transformiert werden. Diese Transformationsprodukte können polarer und weniger toxisch sein als die Ausgangsverbindungen. Bei einigen Organophosphaten sind die Bioaktivitäten einiger Produkte jedoch höher. Zum Beispiel wird Acephat in die giftigeren Methamidophos8,9, und Dimethoat in Omethoat10,11metabolisiert. Pflanzenstoffwechselstudien sind daher wichtig, um das Schicksal eines Pestizids innerhalb einer Pflanze zu bestimmen12.
Pflanzengewebekulturen haben sich als nützliche Plattform für die Untersuchung des Pestizidstoffwechsels erwiesen, mit den identifizierten Metaboliten ähnlich denen in intakten Pflanzengefunden 13,14,15. Die Verwendung von Gewebekulturen, insbesondere Zellsuspensionskulturen, hat mehrere Vorteile. Erstens können Experimente frei von Mikroorganismen durchgeführt werden, wodurch die Interferenz der Pestizidumwandlung oder des Abbaus durch Mikroben vermieden wird. Zweitens bietet die Gewebekultur jederzeit konsistente Materialien für den Einsatz. Drittens sind die Metaboliten leichter aus Gewebekulturen zu extrahieren als aus intakten Pflanzen, und Gewebekulturen haben oft weniger zwischenende Verbindungen und eine geringere Komplexität von Verbindungen. Schließlich können Gewebekulturen leichter verwendet werden, um eine Reihe von Pestizidstoffwechsel in einem einzigen Experiment16zu vergleichen 16 .
In dieser Studie wurde eine Zellsuspension, die aus den Blättern steril angebauter Teepflanzelet gewonnen wurde, erfolgreich etabliert. Die Teezellensuspensionskultur wurde dann verwendet, um das Ableitungsverhalten von sechs systemischen Insektiziden zu vergleichen.
Dieses detaillierte Protokoll soll einige Anleitungen bieten, so dass Forscher eine Pflanzengewebekultur-Plattform einrichten können, die nützlich ist, um das metabolische Schicksal von Xenobiotika im Tee zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel stellt den detaillierten Prozess der Etablierung eines Modells des Pestizidstoffwechsels in Teepflanzengewebe, einschließlich der Auswahl von Expflanzen, die Bestimmung der Zelllebensfähigkeit, und die Etablierung einer Teezellensuspensionskultur mit hoher metabolischer aktivität. Alle Teile eines Pflanzengewebes könnten verwendet werden, um Callus in einer sterilisierten Umgebung zu initiieren25. Teeblätter wurden in dieser Studie für die Callus-Initiation ausgewählt, nicht …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Key Research & Development Program (2016YFD0200900) of China, die National Natural Scientific Foundation of China (Nr. 31772076 und Nr. 31270728), Die China Postdoctoral Science Foundation (2018M630700) und der Open Fund of Of Of China (Nr. 31772076 und Nr. 31270728), die China Postdoctoral Science Foundation (2018M630700) und der Open Fund of Of Fund of China State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization (SKLTOF20180111).
Materials
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
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