Étude sur le métabolisme de six insecticides systémiques dans une culture de suspension cellulaire nouvellement établie dérivée du thé (Camellia Sinensis L.) feuilles
Summary
Ce travail présente un protocole pour établir une culture de suspension cellulaire dérivée de feuilles de thé(Camellia sinensis L.) qui peut être utilisée pour étudier le métabolisme des composés externes qui peuvent être pris par l’ensemble de la plante, tels que les insecticides.
Abstract
Une plate-forme pour étudier le métabolisme des insecticides à l’aide de tissus in vitro de la plante de thé a été développée. Les feuilles des plantulettes stériles de thé ont été induites pour former le callus lâche sur le média basal de Murashige et de Skoog (MS) avec les hormones végétales 2,4-dichlorophenoxyacetic acide (2,4-D, 1.0 mg L-1) et kinetin (KT, 0.1 mg L-1). Callus s’est formé après 3 ou 4 tours de sublituring, chacun d’une durée de 28 jours. Le callus lâche (environ 3 g) a ensuite été inoculé dans le support liquide B5 contenant les mêmes hormones végétales et a été cultivé dans un incubateur secouant (120 tr/min) dans l’obscurité à 25 à 1 oC. Après 3-4 sous-cultures, une suspension cellulaire dérivée de la feuille de thé a été établie à un rapport de sous-culture allant de 1:1 à 1:2 (suspension mère liquide: milieu frais). À l’aide de cette plate-forme, six insecticides (5 g mL-1 chaque thiaméthoxam, imidaclopride, acétamipride, imidaclothiz, diméthoate et omethoate) ont été ajoutés dans la culture de suspension cellulaire dérivée des feuilles de thé. Le métabolisme des insecticides a été suivi à l’aide de chromatographie liquide et de chromatographie gazeuse. Pour valider l’utilité de la culture de suspension de cellules de thé, les métabolites du thiaméthoxan et du diméthoate présents dans les cultures cellulaires traitées et les plantes intactes ont été comparés utilisant la spectrométrie de masse. Dans les cultures traitées de cellules de thé, sept métabolites du thiaméthoxan et deux métabolites du diméthoate ont été trouvés, tandis que dans les usines intactes traitées, seulement deux métabolites du thiamethoxam et un de dimethoate ont été trouvés. L’utilisation d’une suspension cellulaire a simplifié l’analyse métabolique par rapport à l’utilisation de plantes de thé intactes, en particulier pour une matrice difficile comme le thé.
Introduction
Le thé est l’une des boissons non alcoolisées les plus consommées dans le monde1,2. Le thé est produit à partir des feuilles et des bourgeons de la forêt use use vivace Camellia sinensis L. Les plantes à thé sont cultivées dans de vastes plantations et sont sensibles à de nombreux insectes nuisibles3,4. Les insecticides organophosphorés et néonicotinoïdes sont souvent utilisés comme insecticides systémiques5 pour protéger les plants de thé contre les ravageurs tels que les mouches blanches, les larves de feuilles et certaines espèces de lépidoptères 6,7. Après l’application, ces insecticides sont absorbés ou translocalisés dans la plante. À l’intérieur de la plante, ces insecticides systémiques peuvent être transformés par hydrolyse, oxydation ou réactions de réduction par des enzymes végétales. Ces produits de transformation peuvent être plus polaires et moins toxiques que les composés parents. Cependant, pour certains organophosphates, les bioactivités de certains produits sont plus élevées. Par exemple, l’acéfate est métabolisé en methamidophos plus toxiques8,9, et le diméthoate en omethoate10,11. Les études métaboliques végétales sont donc importantes pour déterminer le sort d’un pesticide à l’intérieur d’une plante12.
Les cultures de tissus végétaux se sont avérées être une plate-forme utile pour étudier le métabolisme des pesticides, avec les métabolites identifiés similaires à ceux trouvés dans les plantes intactes13,14,15. L’utilisation des cultures tissulaires, en particulier les cultures de suspension cellulaire, présente plusieurs avantages. Tout d’abord, les expériences peuvent être menées sans micro-organismes, évitant ainsi l’interférence de la transformation ou de la dégradation des pesticides par les microbes. Deuxièmement, la culture tissulaire fournit des matériaux cohérents pour une utilisation à tout moment. Troisièmement, les métabolites sont plus faciles à extraire des cultures tissulaires que des plantes intactes, et les cultures tissulaires ont souvent moins de composés interring et une moindre complexité des composés. Enfin, les cultures tissulaires peuvent plus facilement être utilisées pour comparer une série de métabolisme des pesticides dans une seule expérience16.
Dans cette étude, une suspension de cellules dérivée des feuilles de la plante de thé stérile-cultivée a été avec succès établie. La culture de suspension de cellules de thé a été alors employée pour comparer les comportements de dissipation de six insecticides systémiques.
Ce protocole détaillé est destiné à fournir quelques conseils afin que les chercheurs puissent établir une plate-forme de culture de tissu végétal utile pour étudier le sort métabolique des xénobiotiques dans le thé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article présente le processus détaillé d’établir un modèle du métabolisme de pesticide dans le tissu de plante de thé, y compris la sélection des explants, la détermination de la viabilité de cellules, et l’établissement d’une culture de suspension de cellules de thé avec le métabolisme élevé activité. Toutes les parties d’un tissu végétal pourraient être utilisées pour initier le callus dans un environnement stérilisé25. Les feuilles de thé ont été choisies pour l’ini…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par le National Key Research and Development Program (2016YFD0200900) de Chine, la National Natural Scientific Foundation of China (No. 31772076 et No. 31270728), China Postdoctoral Science Foundation (2018M630700), et Open Fund of State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization (SKLTOF20180111).
Materials
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
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