Estudo sobre o metabolismo de seis inseticidas sistêmicas em uma cultura de suspensão celular recém-estabelecida derivada do chá (Camellia sinensis L.) Folhas
Summary
Este trabalho apresenta um protocolo para o estabelecimento de uma cultura de suspensão celular derivada de folhas de chá (Camellia sinensis L.) que podem ser utilizadas para estudar o metabolismo de compostos externos que podem ser tomados por toda a planta, como inseticidas.
Abstract
Uma plataforma para estudar o metabolismo do insecticida usando in vitro os tecidos da planta de chá foi desenvolvida. As folhas das plântulas de chá estéreis foram induzidas para formar calo solto nos meios basais de Murashige e Skoog (MS) com os hormônios vegetais 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D, 1,0 mg L-1) e CINETINA (KT, 0,1 mg l-1). Callus formado após 3 ou 4 rodadas de subculturação, cada um com duração de 28 dias. O calo frouxo (aproximadamente 3 g) foi inoculado então em meios líquidos B5 que contêm os mesmos hormônios de planta e foi cultivado em uma incubadora de agitação (120 rpm) no escuro em 25 ± 1 ° c. Após 3 − 4 subculturas, uma suspensão da pilha derivada da folha do chá foi estabelecida em uma relação da subcultura que varia entre 1:1 e 1:2 (líquido da mãe da suspensão: meio fresco). Usando esta plataforma, seis insecticidas (5 μg mL-1 cada Thiamethoxam, Imidacloprid, Acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate, e omethoate) foram adicionados na cultura folha-derivada do chá da suspensão da pilha. O metabolismo dos inseticidas foi rastreado usando cromatografia líquida e cromatografia gasosa. Para validar a utilidade da cultura da suspensão da pilha de chá, os metabolitos do tiametoxam e do dimetoato atuais em culturas de pilha tratadas e em plantas intactas foram comparados usando a espectrometria maciça. Em culturas tratadas da pilha de chá, sete Metabolites de tiametoxam e dois Metabolites do dimetoato foram encontrados, quando em plantas intactas tratadas, somente dois Metabolites do tiametoxam e um do dimetoato foram encontrados. O uso de uma suspensão celular simplificou a análise metabólica em comparação com o uso de plantas de chá intactas, especialmente para uma matriz difícil, como o chá.
Introduction
O chá é uma das bebidas não alcoólicas mais consumidas no mundo1,2. O chá é produzido a partir das folhas e gemas do Woodyperene Camellia sinensis L. as plantas de chá são cultivadas em vastas plantações e são suscetíveis a numerosas pragas de insetos3,4. Os insecticidas do organophosphorus e do neonicotinóides são usados frequentemente como insecticidas sistemáticas5 para proteger plantas de chá das pragas tais como whiteflies, funis da folha, e alguma espécie do lepidóptero6,7. Após a aplicação, estes insecticidas são absorvidos ou translocalizados na planta. Dentro da planta, esses inseticidas sistêmicas podem ser transformados por meio de reações de hidrólise, oxidação ou redução por enzimas vegetais. Estes produtos da transformação podem ser mais polares e menos tóxicos do que os compostos do pai. No entanto, para alguns organofosforados, as Bioatividades de alguns produtos são mais elevadas. Por exemplo, o acefato metaboliza-se nos metamidofos mais tóxicos8,9, e dimetoato no ometoato10,11. Os estudos metabólicos da planta são assim importantes para determinar o Fate de um insecticida dentro de uma planta12.
As culturas de tecidos vegetais têm sido provadas como uma plataforma útil para investigar o metabolismo de pesticidas, com os metabólitos identificados semelhantes aos encontrados em plantas intactas13,14,15. O uso de culturas de tecidos, particularmente culturas de suspensão celular, tem várias vantagens. Em primeiro lugar, experimentos podem ser realizados livres de microrganismos, evitando assim a interferência da transformação de pesticidas ou degradação por micróbios. Em segundo lugar, a cultura do tecido fornece materiais consistentes para o uso a qualquer hora. Em terceiro lugar, os metabolitos são mais fáceis de extrair das culturas do tecido do que das plantas intactas, e as culturas do tecido têm frequentemente menos compostos interring e uma mais baixa complexidade dos compostos. Finalmente, as culturas do tecido podem mais facilmente ser usadas para comparar uma série de metabolismo dos insecticidas em um único experimento16.
Neste estudo, uma suspensão da pilha derivada das folhas do plantlet estéril-crescido do chá foi estabelecida com sucesso. A cultura de suspensão de células de chá foi então utilizada para comparar os comportamentos de dissipação de seis inseticidas sistêmicas.
Este protocolo detalhado é pretendido fornecer alguma orientação de modo que os investigadores possam estabelecer uma plataforma da cultura do tecido de planta útil para estudar o Fate metabólico de xenobióticos no chá.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo apresenta o processo detalhado de estabelecimento de um modelo de metabolismo de pesticidas no tecido vegetal do chá, incluindo a seleção de explantes, a determinação da viabilidade celular, e o estabelecimento de uma cultura de suspensão de células de chá com alta metabólica Atividade. Todas as partes de um tecido vegetal podiam ser usadas para iniciar o calo em um ambiente esterilizado25. As folhas de chá foram escolhidas para a iniciação do calo neste estudo, não soment…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo programa nacional de pesquisa & desenvolvimento (2016YFD0200900) da China, a Fundação Nacional de ciência natural da China (n º 31772076 e n º 31270728), China pós-doutorado Science Foundation (2018M630700), e fundo aberto de Laboratório chave do estado da biologia e da utilização da planta do chá (SKLTOF20180111).
Materials
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
References
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H., Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O’Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. . Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
