Análise de fucosilado humanos leite trissacarídeos biotecnológicas contexto usando geneticamente codificado biosensores
Summary
Descrevemos aqui a elevado-throughput detecção e quantificação de oligossacarídeos de leite humano de fucosilado (HMOs) usando um biossensor de células inteiras. Também demonstramos aqui, a adaptação desta plataforma para análise de cepas de produção de HMO, com foco na melhoria da relação sinal / ruído.
Abstract
Oligossacarídeos de leite humano (HMOs) são componentes de hidrato de carbono complexo do leite materno que exibem abundantes benefícios na saúde infantil. No entanto, otimização de sua síntese biotecnológica é limitada pela relativamente baixa taxa de transferência da deteção e quantificação de monossacarídeo e ligações. Técnicas convencionais de análise de glicano incluem métodos cromatográficos/massa-espectrometria com taxa de transferência na ordem de centenas de amostras por dia sem automação. Aqui, demonstramos um biossensor bacteriano geneticamente codificado para a elevado-throughput, enlace específico detecção e quantificação das estruturas fucosilado HMO, 2′-fucosyllactose e 3-fucosyllactose, que alcançamos através de heteróloga expressão de fucosidases. Como a presença de lactose no leite ou em processos biotecnológicos poderia levar a falsos positivos, demonstraremos também a redução do sinal de lactose usando diferentes estratégias. Devido a alta taxa de transferência desta técnica, muitas condições de reação ou parâmetros de biorreator podem ser analisados em paralelo em questão de horas, permitindo a otimização da fabricação de HMO.
Introduction
Oligossacarídeos de leite humano (HMOs) são derivados de lactose oligossacarídeos, geralmente composto por monômeros de açúcar de três a oito. Eles têm uma redução de lactose (Gal-β1, 4-Glc) terminam e são mais alongados por ligações glicosídicas (β-1,3 – ou β-1,6-) para glicose (Glc), galactose (Gal) ou N-acetilglicosamina (GlcNAc). Além disso, a fucose (Fuc, α-1,2 – ou α-1,3-) ou ácido siálico (Sia ou NeuAc, α-2,3 – ou α-2,6-) resíduos são frequentemente adicionados1.
Análise atual de oligossacarídeos e outros carboidratos é limitada em escopo e throughput pela necessidade de espectrometria cromatográfica/de massa (MS) tecnologia2,3,4,5, 6 , 7, que pode demorar mais ou menos uma hora por exemplo, para não mencionar a necessidade de equipamento caro, colunas especializadas e agentes derivatizing e conhecimentos sobre o funcionamento deste equipamento8. Ligações de oligossacarídeo são particularmente difíceis de determinar, exigir avançado MS9,10 ou de técnicas de ressonância magnética nuclear (NMR)11. Otimização rápida da síntese desses oligossacarídeos assim é limitada pela taxa de transferência deste passo lento e analítico.
Neste estudo, demonstramos a deteção de ligação específica de fucosilado trissacarídeo baseada em lactose planos de saúde, enfocando o 2′-fucosyllactose (2′-FL) que é o HMO mais abundante no leite humano, usando um geneticamente codificado toda célula Escherichia coli Biosensor com um limite de detecção em 4 mg/L. Uma característica importante deste biosensor é sua capacidade de distinguir entre trissacarídeos isoméricos. O princípio de projeto baseia-se na expressão de fucosidases específico em e. coli que liberar à lactose de planos de saúde, cuja presença é detectada pelo operon lac , que por sua vez, gera um sinal fluorescente. Conseguimos isso através da construção de um sistema de dois-plasmídeo, um abrigando o enlace específico fucosidase e o outro uma proteína fluorescente repórter. Esta plataforma de biosensor é apropriada para seleção da elevado-produção por citometria de fluxo ou leitor de microplaca. Também demonstramos a utilização do biosensor para quantificar o 2′-FL produzido por uma cepa de engenharia12. Dentro deste estudo, também apresentamos três estratégias na remoção seletiva de lactose que pode resultar em falso sinal positivo do biosensor, dado que a tensão de engenharia produtor é cultivada em lactose.
Os biosensores geneticamente codificados tomados em conjunto, permitem-nos detectar e quantificar a planos de saúde de uma forma de ligação específica, que é difícil mesmo com cromatografia em fase gasosa, MS, ou NMR técnicas. Devido a sua alta produtividade e facilidade de uso, este método deve ter difundidas aplicações na engenharia metabólica e síntese dos planos de saúde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos uma estratégia de alto rendimento para a detecção de ligação específica de fucosilado oligossacarídeos do leite humano. Isso foi conseguido através da construção de biossensores de célula inteira por engenharia genética de e. coli , que, após indução com os glicanos específicos, responder com um sinal fluorescente. O protocolo também detalhes sobre como o biosensor pode ser usado para detectar e quantificar a planos de saúde em uma estirpe bacteriana metabolicamente engenharia.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização Universidade do estado de Iowa. Fe foi parcialmente financiado pela NSF Trinect Fellowship e Manley Hoppe cátedra. T.J.M. foi parcialmente apoiado pela Karen e Denny Vaughn faculdade Fellowship. Os autores agradecer o Iowa University fluxo Cytometry instituição estadual e do W.M. Keck Metabolomics Research Laboratory para assistência com fluorescência e estudos de LC-MS.
Materials
| 2’-Fucosyllactose | Carbosynth | 41263-94-9 | |
| 3-Fucosyllactose | Carbosynth | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Flow Cytometer | BD | FACSCanto Plus RUO | |
| HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC system | |
| HPLC Column | Luna | C18 reversed phase column | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | 11815024 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Lactose | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL detector | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
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