Analyse van de Fucosylated mens melk trisacharide in biotechnologische Context, waarbij het genetisch gecodeerd biosensoren
Summary
Hier beschrijven we de high-throughput detectie en kwantificering van fucosylated menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) met behulp van een geheel-cel biosensor. We ook laten zien hier, de aanpassing van dit platform naar analyse van HMO productie stammen, gericht op het verbeteren van de signaal / ruisverhouding.
Abstract
Menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) zijn onderdelen van de complexe koolhydraten van menselijke moedermelk die overvloedig voordelen op de gezondheid van de baby vertonen. Optimalisatie van hun biotechnologische synthese wordt echter beperkt door de relatief lage doorvoer van detectie en kwantificering van monosaccharide en verbanden. Conventionele technieken van glycan analyse omvatten chromatografische/Massaspectrometrische methoden met doorvoer over de volgorde van honderden monsters per dag zonder automatisering. Wij tonen hier, een genetisch gecodeerde bacteriële biosensor voor de high-throughput, koppelings-specifieke detectie en kwantificering van de fucosylated HMO structuren, 2′-fucosyllactose en 3-fucosyllactose, die we via heterologe bereikt expressie van fucosidases. Als de aanwezigheid van lactose in melk of in biotechnologische processen tot valse positieven leiden kan, tonen we ook de vermindering van signaal uit lactose met behulp van verschillende strategieën. Vanwege de hoge doorvoer van deze techniek, kunnen veel reactie voorwaarden of bioreactor parameters vehiculumcontrolegroep worden parallel in een kwestie van uren, waardoor voor de optimalisatie van de HMO verwerkende industrie.
Introduction
Menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) zijn lactose-afgeleide oligosacharide, meestal bestaande uit drie tot acht suiker monomeren. Ze hebben een lactose (Gal-β1, 4-Glc) verminderen beëindigen en verder door glycosidic links zijn langwerpig (β-1,3 – of β-1,6-) glucose (Glc), galactose (Gal) of N-acetylglucosamine (GlcNAc). Daarnaast fucose (Fuc, α-1,2 – of α-1,3-) of sialic zuur (Sia of NeuAc, α-2,3 – of α-2,6-) residuen worden vaak toegevoegd1.
Huidige analyse van de oligosacchariden en andere koolhydraten in doorvoer en reikwijdte begrensd door de behoefte aan spectrometrische chromatografische/massa (MS) technologie2,3,4,5, 6 , 7, dat ongeveer duren kan een uur per monster, niet te vergeten de noodzaak voor dure apparatuur, gespecialiseerde kolommen en Derivatiserings agenten en expertise over de werking van deze apparatuur8. Oligosaccharide verbanden zijn bijzonder moeilijk te bepalen, waarvoor geavanceerde MS9,10 of11technieken nucleaire magnetische resonantie (NMR). Snelle optimalisatie van synthese van deze oligosachariden is dus beperkt door de doorvoer van deze trage analytische stap.
In deze studie, tonen we koppeling-specifieke detectie van fucosylated trisaccharide lactose gebaseerde zorgorganisaties, gericht op 2′-fucosyllactose (2′-FL) thats de overvloedigste HMO in menselijke melk, met behulp van een genetisch gecodeerde Escherichia coli hele cel biosensor met een limiet van detectie op 4 mg/L. Een belangrijk kenmerk van deze biosensor is haar vermogen om te onderscheiden tussen isomere trisacharide. De ontwerpprincipe is gebaseerd op de expressie van specifieke fucosidases in E. coli die bevrijden lactose van zorgorganisaties, waarvan de aanwezigheid wordt gedetecteerd door het lac -operon, die op zijn beurt een fluorescent signaal genereert. Dit bereiken we door het bouwen van een twee-plasmide-systeem, een herbergen de koppelings-specifieke fucosidase en anderzijds een fluorescerende verslaggever eiwit. Dit platform biosensor is geschikt voor high-throughput screening door stroom cytometry of micro-afleesapparaat. We tonen ook het gebruik van de biosensor in 2′-FL geproduceerd door een gemanipuleerde stam12te kwantificeren. Binnen deze studie presenteren we ook drie strategieën op selectieve verwijdering van lactose die leiden valse positieve signaal van de biosensor tot kan, gezien het feit dat de gemanipuleerde producent stam wordt verbouwd op lactose.
Samen genomen, de genetisch gecodeerde biosensoren laten detecteren en kwantificeren van zorgorganisaties in een koppeling-specifieke wijze, die moeilijk zelfs met is chromatografische, MS of NMR technieken. Vanwege de hoge doorvoer en gebruiksgemak moet deze methode wijdverbreide toepassingen in de metabole engineering en synthese van zorgorganisaties.
Protocol
Representative Results
Discussion
We presenteren een high-throughput strategie voor de koppeling-specifieke detectie van fucosylated menselijke melk oligosacchariden. Dit werd bereikt door het bouwen van hele cel biosensoren door genetisch engineering E. coli die na inductie met specifieke glycanen reageren met een fluorescerende signaal. Het protocol is ook van details over hoe de biosensor kan worden gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van zorgorganisaties in een metabolisch gemanipuleerde bacteriële stam.
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Iowa State University opstarten middelen. VB. werd gedeeltelijk gefinancierd door de NSF Trinect Fellowship en Manley Hoppe hoogleraarschap. T.J.M. werd gedeeltelijk ondersteund door de Karen en Denny Vaughn faculteit Fellowship. De auteurs danken de Iowa State University Stroom Cytometry faciliteit en het W.M. Keck metabolomica onderzoekslaboratorium voor hulp met fluorescentie en LC-MS studies.
Materials
| 2’-Fucosyllactose | Carbosynth | 41263-94-9 | |
| 3-Fucosyllactose | Carbosynth | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Flow Cytometer | BD | FACSCanto Plus RUO | |
| HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC system | |
| HPLC Column | Luna | C18 reversed phase column | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | 11815024 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Lactose | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL detector | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
References
- Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
- Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).
- Royle, L. Chapter 8 – Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).
- Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).
- Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).
- Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).
- Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).
- Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).
- Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).
- Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).
- Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).
- Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).
- Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
- Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).
