遺伝子組み換え生物のコンテキストで次の人間ミルク三糖類の分析エンコード バイオ センサー
Summary
ハイスループット検出と細胞バイオ センサーを用いた次母乳オリゴ糖 (Hmo) の定量化ここで述べる。また示すここでは、このプラットフォーム HMO 生産菌株の解析に向けての適応信号対雑音比を改善に焦点を当てします。
Abstract
母乳オリゴ糖 (Hmo) は、乳児の健康に豊富な利点を示す人間の母乳の複雑な炭水化物コンポーネントです。しかし、彼らのバイオ合成の最適化は、検出のスループットが比較的低くて、単糖類とリンケージの定量化によって制限されます。糖鎖解析技術には、オートメーションを使用せず一日あたりのサンプルの数百のスループットとガスクロマト グラフ/質量分析メソッドがあります。ここでは、高スループット、リンケージ固有の検出と定量化の次 HMO 構造, 2′-fucosyllactose, 3-fucosyllactose、異種を介して実現遺伝的コード化細菌バイオ センサーを紹介します。fucosidases の式。乳糖牛乳またはバイオ プロセスの存在は、偽陽性につながるとまた異なる戦略を使用して乳糖から信号の減少を示します。この手法の高スループットによる HMO 製造の最適化を可能にする時間の問題で並列に多くの反応条件やバイオリアクター パラメーターを試金する可能性があります。
Introduction
母乳オリゴ糖 (Hmo) は通常 3 ~ 8 糖モノマーを含む乳糖由来のオリゴ糖です。彼らは乳糖 (Gal β 1, 4 Glc) の削減を終了し、グリコシド リンクによってさらに長くている (β-1, 3、β 1, 6-) n-アセチルグルコサミン (GlcNAc)、ガラクトース (Gal)、グルコース (Glc) します。また、フコース (α 1, 2 または α 1, 3 フコース-) やシアル酸 (Sia または示さ、α 2, 3 または α 2, 6-) 残基はしばしば1を追加しました。
オリゴ糖や他の炭水化物の現在の分析、ガスクロマト グラフ/質量分析 (MS) 技術2,3,4,5,の必要性によってスループットとスコープの制限します。6,7、ほぼ取ることができるこの装置8の操作に高価な機器、特殊な列と誘導体化剤および専門知識の必要性を述べないために、サンプルあたり 1 時間。オリゴ糖の連携は特に判断が難しい高度な MS9,10または核磁気共鳴 (NMR) 法11を必要とします。これらのオリゴ糖の合成の迅速な最適化従って、この遅い分析ステップのスループットによって制限されます。
本研究でリンケージ固有次三糖類の検出を示す乳糖ベース Hmo は、2′-fucosyllactose (2′ FL) ヒトの乳汁中最も豊富な HMO にあるに焦点を当てて、遺伝的コード化を使用してエシェリヒア属大腸菌のセル全体4 mg/l. の検出限界を用いるバイオ センサーこのバイオ センサーの重要な特徴は、三糖類の異性体を区別する能力です。設計の原則は存在が順番蛍光信号を生成するlacオペロンによって検出された Hmo から乳糖を解放するエシェリヒア属大腸菌の特定の fucosidases の式に基づいています。我々 はリンケージ固有の fucosidase およびその他の蛍光レポーター蛋白質をかくまっている 1 つ 2 プラスミド システムを構築することによってこれを達成します。このバイオ センサー プラットフォームは、フローサイトメトリーやマイクロ プレート リーダーによる高スループット スクリーニングに適しています。また 2 階設計ひずみ12プロデュースの定量化におけるバイオ センサーの使用率を示します。本研究でまた提案する 3 つの戦略、バイオ センサーから偽の肯定的な信号につながる乳糖の選択的除去に関する設計プロデューサーひずみが乳糖で栽培されていることを考える。
一緒に取られて、遺伝的コード化バイオ センサー検出し、Hmo を定量化は困難もリンケージに固有の方法でことができるクロマトグラフィー、MS、または NMR テクニック。高スループットを実現、使いやすさのためこのメソッドは Hmo の合成と代謝工学の広範なアプリケーションに必要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
母乳オリゴ糖次のリンケージ固有の検出のための高スループット戦略を提案します。これは、大腸菌その特定の糖鎖を持つ誘導蛍光信号で応答を遺伝子工学で全細胞バイオ センサーを構築することにより達成されました。プロトコルは、バイオ センサーを使用して検出し、菌株の代謝改変で Hmo を定量化する方法についても詳しく説明します。
提案プロトコルで?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、アイオワ州立大学スタートアップ資金によって支えられました。F. e. は NSF Trinect 親睦とマンリー ホッピ教授によって部分的に資金を供給されました。T.J.M. は、カレンとデニー ・ ヴォーン教員フェローシップによって部分的に支えられました。著者らは、蛍光と LC MS 研究アイオワ州立大学流れ Cytometry 施設と支援のため W.m.keck メタボロミクス研究所をありがとうございます。
Materials
| 2’-Fucosyllactose | Carbosynth | 41263-94-9 | |
| 3-Fucosyllactose | Carbosynth | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Flow Cytometer | BD | FACSCanto Plus RUO | |
| HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC system | |
| HPLC Column | Luna | C18 reversed phase column | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | 11815024 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Lactose | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL detector | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
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