Analyse der Fucosylated menschlichen Milch Trisaccharides in biotechnologischen Zusammenhang mit genetisch codierte Biosensoren
Summary
Wir beschreiben hier die Hochdurchsatz-Erkennung und Quantifizierung von Fucosylated Muttermilch-Oligosaccharide (HMOs) mit einer ganzen Zelle Biosensor. Wir zeigen auch hier, die Anpassung dieser Plattform zur Analyse von HMO Produktionsstämme, mit Schwerpunkt auf das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
Abstract
Muttermilch-Oligosaccharide (HMOs) sind komplexe Kohlenhydrate Komponenten der menschlichen Muttermilch, die reichlich Vorteile auf Kleinkinder Gesundheit aufweisen. Optimierung ihrer biotechnologischen Synthese ist jedoch durch den relativ geringen Durchsatz der Erkennung und Quantifizierung von Monosaccharid und Verbindungen beschränkt. Konventionelle Techniken der Glycan Analyse gehören chromatographische/Masse-spektrometrische Methoden mit Durchsatz in der Größenordnung von Hunderten von Proben pro Tag ohne Automatisierung. Wir zeigen hier eine genetisch codierte bakterielle Biosensor für den Hochdurchsatz-, Gestänge-spezifische Erkennung und Quantifizierung von Fucosylated HMO Strukturen, 2′-Fucosyllactose und 3-Fucosyllactose, die wir über heterologe erreicht Ausdruck von Fucosidases. Da das Vorhandensein von Laktose in der Milch oder in biotechnologischen Prozessen zu Fehlalarmen führen kann, zeigen wir auch die Reduzierung des Signals aus Laktose mit unterschiedlichen Strategien. Aufgrund der hohen Durchsatz dieser Technik könnte vielen Reaktionsbedingungen oder Bioreaktor Parameter parallel in einer Angelegenheit von Stunden, ermöglicht die Optimierung der HMO Fertigung untersucht.
Introduction
Muttermilch-Oligosaccharide (HMOs) sind Laktose-abgeleitete Oligosaccharide, meist bestehend aus drei bis acht Zucker Monomere. Sie haben eine Laktose (Gal-β1, 4-Glc) verringern zu beenden und sind weiter durch Glykosid-Links länglich (β-1,3 – oder β-1,6-) Glukose (Glc), Galaktose (Gal) oder N-Acetylglucosamin (GlcNAc). Darüber hinaus Fucose (Fuc, α-1,2 – oder α-1,3-) oder Sialinsäure Säure (Sia oder NeuAc, α-2,3 – oder α-2,6-) Rückstände werden oft1hinzugefügt.
Aktuelle Analyse der Oligosaccharide und anderen Kohlenhydraten wird durch die Notwendigkeit spektrometrische chromatographische/Masse (MS) Technologie2,3,4,5, Durchsatz und Umfang begrenzt. 6 , 7, was ungefähr dauern kann eine Stunde pro Probe, ganz zu schweigen von der Notwendigkeit für teure Ausrüstung, spezielle Spalten und derivatizing Agenten und Know-how über die Funktionsweise dieser Geräte8. Oligosaccharid-Verbindungen sind besonders schwer zu bestimmen, erfordert fortgeschrittene MS9,10 oder Kernspinresonanz (NMR) Techniken11. Schnelle Optimierung der Synthese von diese Oligosaccharide ist somit durch den Durchsatz dieser langsamen analytischen Schritt begrenzt.
In der vorliegenden Studie zeigen wir Gestänge-spezifischen Nachweis von Fucosylated Trisaccharide Laktose-basierte HMOs, mit Schwerpunkt auf 2′-Fucosyllactose (2′-FL), die am häufigsten vorkommende HMO in der Muttermilch ist, mit Hilfe einer genetisch codierte Escherichia coli ganze Zelle Biosensor mit einem Limit von Erkennung bei 4 mg/L. Ein wichtiges Merkmal dieser Biosensor ist seine Fähigkeit, zwischen Isomeren Trisaccharides unterscheiden. Das Konstruktionsprinzip basiert auf die Expression von bestimmten Fucosidases in E. Coli , die Laktose von HMOs, befreien das Vorhandensein von Lac -Operon, erkannt wird, die wiederum ein Fluoreszenzsignal erzeugt. Dies erreichen wir durch den Bau eines zwei-Plasmid-System, ein beherbergen die Gestänge-spezifische Fucosidase und andererseits eine fluoreszierende Reporter-Protein. Diese Biosensor-Plattform eignet sich für Hochdurchsatz-Screening von Durchflusszytometrie oder Mikro-Platte-Leser. Wir zeigen auch die Auslastung der Biosensor in 2′-FL produziert durch ein veränderter Belastung12zu quantifizieren. Im Rahmen dieser Studie präsentieren wir auch drei Strategien auf selektive Entfernung von Laktose, die false positives Signal aus der Biosensor ergeben können, angesichts der Tatsache, dass die technische Produzent Belastung auf Laktose angebaut wird.
Zusammen genommen, der genetisch codierten Biosensoren ermöglichen es uns, zu erkennen und zu quantifizieren HMOs Gestänge-spezifisch, die schwer selbst mit chromatographischen, MS oder NMR Techniken. Aufgrund seiner hohen Durchsatz und Benutzerfreundlichkeit sollte diese Methode weit verbreitete Anwendungen in das metabolic Engineering und Synthese von HMOs haben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir präsentieren eine Hochdurchsatz-Strategie für die Gestänge-spezifische Erkennung des Fucosylated der Muttermilch-Oligosaccharide. Dies wurde erreicht durch den Bau der ganzen Zelle Biosensoren durch genetisch Technik Escherichia Coli die auf Induktion mit spezifischen Glykane mit ein Fluoreszenzsignal reagieren. Das Protokoll auch details wie der Biosensor zu erkennen und zu quantifizieren HMOs in ein metabolisch veränderter Bakterienstamm eingesetzt werden kann.
Unser Protoko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Iowa State University Startup Fonds unterstützt. Z.B. wurde teilweise durch die NSF Trinect Fellowship und Manley Hoppe Professur finanziert. T.J.M. wurde teilweise von Karen und Denny Vaughn Faculty Fellowship unterstützt. Die Autoren danken die Iowa State Universität Flow Cytometry Anlage und des w.m. Keck Metabolomik Forschungslabors für Hilfe mit Fluoreszenz und LC-MS-Studien.
Materials
| 2’-Fucosyllactose | Carbosynth | 41263-94-9 | |
| 3-Fucosyllactose | Carbosynth | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Flow Cytometer | BD | FACSCanto Plus RUO | |
| HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC system | |
| HPLC Column | Luna | C18 reversed phase column | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | 11815024 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Lactose | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL detector | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
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